肾宝片补肾作用及机制研究

孙建辉　周青罡　沈丽琴　霍海如　李小芹　李洪梅

[摘要] 目的 研究腎宝片的补肾作用，并探讨其作用机制。 方法 采用腺嘌呤致Wistar大鼠肾阳虚模型，按体重随机分为正常对照组，模型对照组，肾宝片1.14、0.57、0.29 g/kg剂量组，枸橼酸西地那非片组，每组13只。除正常对照组外，其余大鼠灌胃腺嘌呤500 mg/kg体重，连续10 d。造模第二天开始各组分别灌胃给药，正常对照组和模型对照组灌胃相同容积的蒸馏水，连续给药24 d。比较各组大鼠体重、自主活动次数、低温游泳存活时间、血清睾酮（T）、血尿素氮（BUN）、肌酐（Cre）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、环磷酸鸟苷（cGMP）及总一氧化氮合酶（NOS）水平。采用去势大鼠模型，按体重随机选取12只为正常对照组，其余大鼠进行去势手术，将去势大鼠按体重随机分为模型对照组、肾宝片2.28、1.14、0.57 g/kg剂量组及枸橼酸西地那非片组，每组12只。各组分别灌胃给药，1次/d，连续给药24 d，正常对照组和模型对照组灌胃相同容积的蒸馏水。比较各组勃起潜伏期、阴茎海绵体内压/血压（ICP/BP）、cGMP和总NOS及血清T水平。 结果 肾阳虚模型对照组体重、自主活动次数、低温游泳存活时间、血清T含量、阴茎海绵体内cGMP水平低于正常对照组，血清BUN、Cre、MDA含量高于正常对照组（P < 0.05）。肾宝片1.14、0.57、0.29 g/kg剂量组低温游泳存活时间长于模型对照组、血清BUN含量低于模型对照组，肾宝片1.14、0.57 g/kg剂量组自主活动次数、阴茎海绵体内cGMP水平高于模型对照组，肾宝片0.57 g/kg剂量组血清T含量、SOD活性高于模型对照组、Cre含量低于模型对照组（均P < 0.05）;肾宝片1.14、0.57、0.29 g/kg剂量组体重、血清MDA含量、阴茎海绵体内总NOS水平与模型对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。去势大鼠模型对照组勃起潜伏期高于正常对照组，血清T含量、阴茎海绵体ICP值、ICP/BP比值、阴茎海绵体内cGMP水平低于正常对照组（P < 0.01）。肾宝片2.28、1.14、0.57 g/kg剂量组勃起潜伏期低于模型对照组，血清T含量、阴茎海绵体ICP值、ICP/BP比值高于模型对照组，肾宝片2.28 g/kg剂量组阴茎海绵体内cGMP水平高于模型对照组（均P < 0.05）;肾宝片2.28、1.14、0.57 g/kg剂量组BP值、阴茎海绵体总NOS水平与模型对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 肾宝片具有补肾作用，其作用机制与增强雄激素含量、NO/cGMP通路活性以及SOD活性有关。

[关键词] 肾宝片;补肾;肾阳虚;睾酮;环磷酸鸟苷;阴茎海绵体内压力

[中图分类号] R256.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）06（c）-0004-06

[Abstract] Objective To study the kidney-tonifying effect of Shenbao Tablets and explore its mechanism. Methods The model of kidney-yang deficiency of Wistar rats induced by adenine was adopted. They were randomly divided into normal control group， model control group， Shenbao Tablets 1.14， 0.57 and 0.29 g/kg dose groups， Sildenafil Citrate Tablets group， with 13 rats in each group. Except the normal control group， the other rats were gavaged with adenosine 500 mg/kg for 10 d. On the second day of modeling， each group was administrated by gavage for 24 d. The body weight， the number of independent activities， the survival time of swimming at low temperature， the serum testosterone （T）， blood urea nitrogen （BUN）， creatinine （Cre）， serum superoxide dismutase （SOD）， malondialdehyde （MDA）， cyclic guanosine phosphate （cGMP） and total nitric oxide synthase （NOS） were compared in each group. The castrated rat model was used， and 12 rats were randomly selected according to the body weight as the normal control group. The remaining rats were castrated. The castrated rats were randomly divided into model control group， Shenbao Tablets 2.28， 1.14 and 0.57 g/kg dose groups， and Sildenafil Citrate Tablets group， with 12 rats in each group. Each group was administrated by gavage once a day for 24 d， normal control group and model control group were gavaged the same volume of distilled water. The erectile latency，intracavernous pressure/blood pressure （ICP/BP）， cGMP and total NOS levels and serum T levels were compared in each group. Results The body weight， the number of independent activities， the survival time of low temperature swimming， serum T levels and cGMP in penile sponge in model control group of kidney-yang deficiency were lower than those in normal control group， and serum BUN， Cre and MDA levels were higher than those in normal control group （P < 0.05）. The survival time of low temperature swimming of Shenbao Tablets 1.14， 0.57 and 0.29 g/kg dose groups were longer than those of model control group， the BUN content was lower than that of model control group， the number of independent activities and cGMP levels in penile sponge of Shenbao Tablets 1.14 and 0.57 g/kg dose groups were higher than those of model control group， the serum T content and SOD activity of Shenbao Tablets 0.57 g/kg dose group were higher than those of model control group， and the Cre content was lower than that of model control group （all P < 0.05）. There were no significant differences in the body weight， serum MDA content and total NOS levels in penile sponge in Shenbao Tablets 1.14， 0.57， 0.29 g/kg dose groups and model control group （P > 0.05）. The erectile latency of castrated rats in model control group was higher than that in normal control group， and the serum T content， ICP value， ICP/BP ratio， cGMP level of penile sponge were lower than those in normal control group （P < 0.01）. The erectile latency of Shenbao Tablets 2.28， 1.14 and 0.57 g/kg dose groups were lower than those of model control group， the serum T content， ICP value and ICP/BP ratio of penile sponge were higher than those of model control group， the cGMP levels of penile sponge in Shenbao Tablets 2.28 g/kg dose group were higher than those of model control group （all P < 0.05）. There were no significant differences in BP value and total NOS of penile sponge in Shenbao Tablets 2.28， 1.14 and 0.57 g/kg dose groups and model control group （P > 0.05）. Conclusion Shenbao Tablets has the effect of kidney-tonifying， and its mechanism is related to the increase of androgen content， the enhancement of NO/cGMP pathway activity and SOD activity.

[Key words] Shenbao Tablets; Kidney-tonifying; Kidney-yang deficiency; Testosterone; Cyclic guanosine phosphate; Intracavernous pressure

中医认为肾藏精，主天葵，为先天之本。肾中精气内寓元阴元阳，即肾阴肾阳。肾阳为周身阳气之根本。若先天禀赋不足、久病劳倦、饮食不节、房事过度或年老体虚等，均可导致肾阳不足。肾阳虚证的主要症状包括面色发白、四肢冰冷、精神萎靡、遗精尿频、四肢浮肿、胸闷气短、痰多心悸、虚弱无力等[1]。久病及肾，肾精亏损、肾气不足是各种慢性病发展的必然转归[2]。肾主生殖，人到老年往往出现生理性肾虚，此时下丘脑-垂体-性腺轴发生明显改变，随年龄增长，男性血浆睾酮水平呈下降趋势;温肾阳中药可调节改善[3]。中医认为男性勃起多与肾有关，对勃起功能障碍多数医家认为肾虚为本，肝郁气滞、血瘀、湿热等为标，各种病理因素单一或联合作用于人体以致本病[4]。李曰庆教授认为勃起功能障碍最常见的病因是肾虚、肝郁、血瘀以及湿热，肾虚是发病之本，肝郁是病变之标[5]。肾阳亏虚是勃起功能障碍的主要病机，治疗上以温补肾阳为主。

肾宝片由淫羊藿、葫芦巴、金樱子、熟地黄等22味中药制成，具有调和阴阳，温阳补肾，扶正固本的作用。肾宝片是在肾宝合剂基础上改进而来，肾宝合剂为《中华人民共和国药典》[6]2015年版收载药品，研究显示[7]，肾宝合剂具有助阳与改善性功能的药理作用。本研究采用腺嘌呤所致大鼠肾阳虚模型和去势大鼠模型，评价肾宝片的补肾作用，并从性激素水平、一氧化氮-环磷酸鸟苷（NO-cGMP）通路、抗氧化等方面探讨肾宝片的补肾作用机制，为临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Wistar大鼠，雄性，体重160～180 g 78只、90～110 g 72只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号为SCXK（京）2012-0001。饲养在屏障环境，实验动物使用许可证号：SYXK（京）2010-0034。本实验遵循实验动物保护和使用指南，并获得中国中医科学院中药研究所实验动物伦理委员会批准。

1.2试药与仪器

肾宝片，江西汇仁药业有限公司，批号：1301004;枸橼酸西地那非片，辉瑞制药有限公司，批号：1283002;YLS-1B多功能大鼠自主活动记录仪，济南益延科技有限公司;RT-6000型酶标分析仪，深圳雷杜生命科学股份有限公司;AVE型半自动生化分析仪，爱威科技实业有限公司;M150多导电生理仪，美国Biopac公司;5922型离心机，KUBOTA公司。腺嘌呤，Amersco公司，有效期至03/2015。

1.3 方法

1.3.1 剂量设计

肾宝片，临床用量9片/d，每片重0.7 g，按60 kg体重计算为0.105 g/kg，按动物与人公斤体重等效剂量折算，大鼠用0.57 g/kg为临床等效剂量。枸橼酸西地那非片，临床推荐用量50 mg/d，按60 kg体重计算为0.83 mg/kg，按动物与人公斤体重等效剂量折算，大鼠用4.5 mg/kg为临床等效剂量。

1.3.2 肾宝片对腺嘌呤致大鼠肾阳虚模型的影响

1.3.2.1 动物分组、造模、给药  选取160～180 g健康Wistar大鼠78只，按体重随机分为正常对照组，模型对照组，肾宝片1.14、0.57、0.29 g/kg剂量组，枸橼酸西地那非片组，每组13只。造模[8]：除正常对照组外，其余大鼠灌胃腺嘌呤500 mg/kg体重，连续10 d。造模第二天开始各组分别灌胃给药，正常对照组和模型对照组灌胃相同容积的蒸馏水（10 mL/kg），连续给药24 d。模型对照组体重明显低于正常对照组，提示动物模型制备成功[3]。

1.3.2.2 动物自主活动次数的测定  采用YLS-1B型多功能大鼠自主活动记录仪，记录大鼠10 min内的自主活动次数。

1.3.2.3 低温游泳存活时间的测定  在不锈钢水槽内加水、冰，控制水温在（10.0±0.5）℃，将动物放入水槽内游泳开始计时，至大鼠头部沉入水中10 s不能浮出水面，此时间为低温游泳存活时间。

1.3.2.4 血清睾酮（T）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cre）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的檢测  采用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，眼眶取血，3000 r/min离心15 min（离心半径为16.71 cm），分离血清，测定血清中T、BUN、Cre、SOD、MDA含量，按试剂盒说明书进行操作。

大鼠T ELISA试剂盒（BlueGene公司，批号：20130422）;BUN试剂盒（OPA法，北京北化康泰临床试剂有限公司，批号：20130102）;Cre试剂盒（苦味酸不除蛋白法，北京北化康泰临床试剂有限公司，批号：20130123）;SOD试剂盒（羟胺法，南京建成生物工程研究所，批号：20130313）;MDA试剂盒（TBA法，南京建成生物工程研究所，批号：20130329）。

1.3.2.5 阴茎海绵体内cGMP和总一氧化氮合酶（NOS）水平的测定  采用大鼠cGMP ELISA试剂盒（BlueGene公司，批号：20130422）、NOS测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20130419）测定，按说明书操作。

1.3.3肾宝片对去势大鼠模型的影响

1.3.3.1动物造模、分组、给药  选取90～110 g健康Wistar大鼠，72只。造模：按体重随机选取12只大鼠作为正常对照组，其余大鼠参考文献[9]，进行去势手术。分组：手术3 d后，将去势大鼠按体重随机分组，分别为模型对照组、肾宝片2.28、1.14、0.57 g/kg剂量组，枸橼酸西地那非片组，每组12只。各组分别灌胃给药，1次/d，连续给药24 d，正常对照组和模型对照组灌胃相同容积的蒸馏水（10 mL/kg）。

1.3.3.2 勃起潜伏期的测定  将刺激电极置于大鼠阴茎部位，给予局部电刺激，电流强度为4 mA，从刺激开始至阴茎勃起时间为勃起潜伏期。

1.3.3.3 阴茎海绵体内压（ICP）及ICP/BP的测定  参考文献[10]，分离、暴露大鼠阴茎海绵体，采用Biopac电生理仪，测定血压（BP）和ICP，计算ICP/BP的比值。

1.3.3.4 血清T含量的测定  取血，离心，分离血清，操作同“1.3.2.4”，采用大鼠T ELISA试剂盒（BlueGene公司，批号：20130722）测定，按说明书操作。

1.3.3.5 阴茎海绵体内cGMP和总NOS水平的测定  测定方法同“1.3.2.5”。大鼠cGMP ELISA试剂盒，BlueGene公司，批号：20130722;总NOS测定试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20130716。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾宝片对腺嘌呤致大鼠肾阳虚模型的研究结果

2.1.1 肾宝片对大鼠肾阳虚模型体重的影响

模型对照组结束时体重明显低于正常对照组，差异有高度统计学意义（P < 0.01），提示动物模型制备成功。肾宝片1.14、0.57、0.29 g/kg剂量组体重与模型对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.1.2 肾宝片对肾阳虚模型自主活动次数、低温游泳存活时间的影响

模型对照组大鼠自主活动次数、低温游泳存活时间低于正常对照组，差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）。肾宝片1.14、0.57 g/kg剂量组及枸橼酸西地那非片组大鼠自主活动次数高于模型对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05或P < 0.01）;肾宝片1.14、0.57、0.29 g/kg剂量组及枸橼酸西地那非片组低温游泳存活时间长于模型对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见表2。

3.1.3 肾宝片对大鼠肾阳虚模型血清中T、BUN、Cre含量的影响

模型对照组血清T含量低于正常对照组，BUN、Cre含量高于正常对照组，差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）。肾宝片0.57 g/kg剂量组T含量高于模型对照组，肾宝片1.14、0.57、0.29 g/kg剂量组及枸橼酸西地那非片组BUN含量低于模型对照组，肾宝片0.57 g/kg剂量组、枸橼酸西地那非片组Cre含量低于模型对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见表3。

2.1.4 肾宝片对大鼠肾阳虚模型血清SOD、MDA含量的影响

肾宝片0.57 g/kg剂量组、枸橼酸西地那非片组血清SOD活性高于模型对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。模型对照组MDA含量高于正常对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表4。

2.1.5 肾宝片对肾阳虚模型阴茎海绵体内cGMP和总NOS含量的影响

模型对照组阴茎海绵体内cGMP水平低于正常对照组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）;肾宝片1.14、0.57 g/kg剂量组及枸橼酸西地那非片组阴茎海绵体内cGMP水平高于模型对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。肾宝片1.14、0.57、0.29 g/kg剂量组阴茎海绵体内总NOS含量与模型对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表5。

2.2 肾宝片对去势大鼠模型的研究结果

2.2.1 肾宝片对去势大鼠勃起潜伏期、血清T含量的影响

模型对照组大鼠勃起潜伏期长于正常对照组;血清T含量低于正常对照组，差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）。肾宝片2.28、1.14、0.57 g/kg剂量组及枸橼酸西地那非片组勃起潜伏期短于模型对照组;血清T含量高于模型对照组，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表6。

2.2.2 肾宝片对去勢大鼠阴茎海绵体ICP、BP及ICP/BP的影响

模型对照组阴茎海绵体ICP值、ICP/BP比值低于正常对照组，差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）。肾宝片2.28、1.14、0.57 g/kg剂量组及枸橼酸西地那非片组阴茎海绵体ICP值、ICP/BP比值高于模型对照组，差异均有高度统计学意义（均P < 0.01）。肾宝片2.28、1.14、0.57 g/kg剂量组BP值与模型对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表7。

2.2.3 肾宝片对去势大鼠阴茎海绵体内cGMP和总NOS水平的影响

模型对照组大鼠阴茎海绵体内cGMP水平低于正常对照组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）;肾宝片2.28 g/kg剂量组、枸橼酸西地那非片组阴茎海绵体内cGMP水平高于模型对照组，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。肾宝片2.28、1.14、0.57 g/kg剂量组总NOS水平与模型对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表8。

4 讨论

肾宝片中淫羊藿、葫芦巴、补骨脂、蛇床子、肉苁蓉温补肾阳，金樱子、菟丝子、覆盆子固精缩尿，熟地黄补血滋阴、益精填髓，制何首乌、枸杞子、菟丝子滋补肝肾，五味子收敛固涩、补肾宁心，黄芪补气升阳，红参大补元气，白术健脾益气，山药补脾补肾，茯苓健脾宁心，当归补血活血，川芎活血行气，小茴香散寒理气，车前子清热通淋，炙甘草补脾益气，全方配伍，共同发挥调和阴阳，温阳补肾，扶正固本的作用。研究显示单味药淫羊藿[11]、肉苁蓉[12]、熟地黄[13]等具有补肾作用。

动物体重下降、自主活动减少、抗应激能力下降、血清T含量降低、肾功能改变等作为肾阳虚证动物模型的诊断指标[3，14]。本研究采用腺嘌呤造成大鼠肾阳虚模型，模型对照组体重、自主活动次数、低温游泳存活时间、T含量均低于正常对照组，模型对照组血清BUN、Cre含量高于正常对照组（均P < 0.05），提示肾阳虚模型成立。肾宝片可增加肾阳虚模型自主活动次数、低温游泳存活时间，降低血清BUN、Cre含量，提示肾宝片具有明显的补肾、护肾作用。在去势等极端情况下，雄性的勃起功能亦可受到显著影响。据报道[15]在大鼠模型中，去势可减少海绵体动脉流量、诱发静脉漏，并使刺激海绵体神经诱发的勃起反应降低约50%。ICP测定是判断阴茎勃起功能的金标准[16]。本研究采用去势大鼠模型，所测指标如勃起潜伏期、阴茎海绵体ICP值、血清T含量等均显示造模成功;肾宝片可明显缩短勃起潜伏期，增加阴茎海绵体ICP值及ICP/BP比值，提示肾宝片具有补肾作用。

肾藏精功能与性激素关系密切，温肾能改善肾功能，也能增加雄性激素水平[17]。T水平降低通常与肥胖、糖尿病、高脂血症和代谢综合征等代谢性疾病伴发，还可影响患者的勃起功能。T作为男性的主要雄性激素，20～29岁时达高峰，以后随年龄增高而下降[18]。本研究结果显示，肾宝片可增加肾阳虚模型和去势大鼠的血清T含量，提示肾宝片可能通过下丘脑-垂体-性腺轴发挥补肾作用。

NO/cGMP通路是目前与阴茎勃起相关的最为经典、研究最为深入的分子信号通路。当性刺激信号传递至阴茎海绵体时，左旋精氨酸在NOS作用下产生NO，NO进入海绵体平滑肌细胞内刺激可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）将三磷酸鸟苷（GTP）转化为最为重要的第二信使cGMP，后者激活cGMP特异性蛋白激酶（PKG），进而对多种离子通道产生影响，使海绵体平滑肌舒张，诱发阴茎组织充血勃起[19]。单体成分淫羊藿苷能明显抑制磷酸二酯酶5活性，增加cGMP在阴茎海绵体平滑肌细胞内的浓度，增强NO/cGMP通路活性，从而松弛阴茎海绵体平滑肌，改善勃起功能[20]。本研究结果显示肾宝片可增加肾阳虚模型和去势大鼠的阴茎海绵体cGMP水平，提示肾宝片可能通过NO/cGMP通路发挥补肾作用。

肾气虚衰是衰老的主要原因，衰老的自由基学说认为自由基对机体的损伤与毒害是导致人体衰老的最重要的因素。随着年龄的增殖，体内清除自由基的酶类和非酶系统的功能逐渐衰减，自由基在体内聚积的量不断增加，对机体的持续性损害导致衰老的发生[21]。本研究结果显示，肾宝片可增加肾阳虚模型血清SOD活性，提示抗氧化可能是其补肾作用机制之一。

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（收稿日期：2020-02-18  本文编辑：刘明玉）