miR-375、miR-146a及miR-21在慢性乙型病毒性肝炎、肝硬化及肝癌患者中表达及其对肝癌的诊断意义

昝丽娜 孙峰 张永娟 张静

(亳州市人民医院检验中心，安徽 亳州 236800)

慢性乙型病毒性肝炎(简称乙肝)是临床常见的一种可通过血液、体液接触而传播的疾病〔1〕。肝硬化是一种肝损害疾病，临床表现为压痛、肝功能减退、黄疸、腹胀、黑便及腹水等，其病程缓慢并伴有各种并发症，如消化道出血、肝性脑病及肝肾综合征等，当进入失代偿阶段时易发生癌变，从而进展为肝癌〔2,3〕。肝癌在人类恶性肿瘤中可排前3位，是肝细胞或胆管细胞发生恶性病变所致。肝癌的发病率及死亡率均较高，严重威胁人类的生命健康〔4〕。肝癌的发病与乙肝、肝硬化均有着密切关系，肝癌的高发生率一部分原因是由乙型肝炎病毒(HBV)感染所致〔5〕。由于缺乏早期有效的诊断，大部分肝癌患者一旦发现就处于中晚期，错过最佳手术时机，导致患者预后较差〔6〕。因此寻找灵敏度高、特异度好的肝癌标志物是目前医学研究的热点。HBV-DNA、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷氨酰转肽酶(GGT)和碱性磷酸酶(ALP)是常规的实验室检测项目，而miRNA是一种调节基因表达关键的因子，研究证实，其在肝癌的发生及发展中起到十分重要的作用〔7〕。miRNA在血浆中可稳定存在，可通过检测患者血清的方式对其表达情况进行观察。本研究通过对慢性乙肝患者、肝硬化患者及肝癌患者实验室常规项目及血清中miRNA(miR)-375、miR-146a及miR-21表达进行检测，以期为肝癌的早期诊断提供依据和新的研究方向。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年3月至2018年2月毫州市人民医院收治的43例慢性乙肝患者纳入慢性乙肝组，36例肝硬化患者纳入肝硬化组，31例肝癌患者纳入肝癌组，慢性乙肝患组男29例，女14例，平均年龄(58.85±7.89)岁；肝硬化组男25例，女11例，平均年龄(59.13±7.65)岁；肝癌男21例，女10例，平均年龄(63.22±7.93)岁；3组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，有可比性。纳入标准：①符合慢性乙型肝炎、肝硬化及肝癌的诊断标准〔8～10〕；②病例资料完整；③签署知情同意书；排除标准：①伴有精神类疾病；②合并心脑肾等重要器官障碍者；③其他恶性肿瘤患者。

1.2方法

1.2.1相关仪器及试剂 实验主要仪器为：全自动生化分析仪(美国贝克曼)、实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)扩增仪(上海宏石)、离心机(上海强生医疗器材有限公司)、S100型PCR扩增仪(美国Bio-Rad公司)、水浴锅(常州诺基仪器有限公司)、垂直电泳仪(美国Bio-Rad公司)、Tanon 1600凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)；主要试剂：裂解液(德国Qiagen公司)、Trizol试剂(美国Invitrogen公司)、反转录试剂盒(日本Takara公司)、Taqman microRNA 探针(美国Applied Biosystems公司)。

1.2.2样本采集 采集3组外周静脉血(禁食8 h)5 ml，20℃下静置30 min，离心机2 500 r/min离心10 min，取上清，5 000 r/min离心10 min，检测HBV-DNA、ALT、AST、GGT和ALP，其余血清置入-80℃冰箱备存，用于miR-375、miR-146a及miR-21的批量检测。

1.2.3miR-375、miR-146a及miR-21检测 采用qRT-PCR技术检测miR-375、miR-146a及miR-21的表达：①取出样本并进行解冻；②按照Trizol试剂的说明书提取组织总RNA(纯度比值范围控制：1.8～2.0)；③标记microRNA，并进行miRNA芯片杂交，并扫描及数据分析；④选取miRNA芯片结果中的miR-375、miR-146a及miR-21进行荧光定PCR分析：采用反转录试剂盒配置反应混合物，反转录合成环状DNA；RT-PCR反应条件：95℃变性10 s，60℃退火20 s，70℃延伸10 s，40个循环，相关引物序列由上海生工公司提供，每个样品目的基因的CT值用内参基因(U6RNA)来进行归一化，获得实验样品和对照样品的△CT值，目的基因相对U6的表达量=2-△CT，最后计算miR-375、miR-146a及miR-21相对表达量2-△△CT。

1.3统计学方法 采用SPSS20.0软件进行F检验、χ2检验、受试者工作特征(ROC)曲线分析。

2 结 果

2.13组血清HBV-DNA阳性率比较 肝硬化组血清HBV-DNA阳性率〔23例(63.89%)〕明显低于慢性乙肝组〔39例(90.70%)〕和肝癌组〔28例(90.32%)〕，差异均有统计学意义(χ2=11.57，P<0.05)；慢性乙肝组血清HBV-DNA阳性率与肝癌组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.23组血清ALT、AST、GGT和ALP水平比较 3组血清ALT、AST、GGT和ALP水平比较差异均有统计学意义(P<0.05)，肝癌组血清ALT、AST水平明显低于慢性乙肝患者，血清ALP水平明显高于慢性乙肝组(P<0.05)；肝癌组血清GGT水平明显高于慢性乙肝组和肝硬化组(P<0.05)。见表1。

表1 3组血清ALT、AST、GGT和ALP水平比较

2.33组血清miR-375、miR-146a及miR-21表达情况 miR-146a及miR-21在慢性乙肝组、肝硬化组及肝癌组血清中的水平呈现显著增高趋势，miR-375表达则呈现显著下调趋势(P<0.05)，见表2。

表2 3组miR-375、miR-146a及miR-21表达情况

2.4miR-375、miR-146a及miR-21对肝癌诊断情况 miR-375、miR-146a及miR-21三者联合对肝癌的诊断效能明显优于使用单一指标(P<0.05)，见表3，图1。

表3 miR-375、miR-146a及miR-21对肝癌诊断情况分析

图1 miR-375、miR-146a及miR-21对肝癌的诊断价值

3 讨 论

全球范围内有超过3.5亿的慢性乙肝患者，每年约60万慢性乙肝患者发生死亡，慢性乙肝是导致肝硬化及肝癌的重要原因〔11〕。慢性乙肝的发病机制十分复杂，目前仍不能完全阐述清晰，其可能与凋亡相同基因、自身免疫及肝炎病毒等多种因素作用有关〔12〕。慢性乙肝具有经久不愈及反复发作的特点，随着病情的发展，大量肝细胞凋亡，肝功能障碍严重，易导致肝纤维化，进行形成肝硬化〔13〕。通常肝硬化的起病较隐匿，病程较长，可持续3～10年〔14〕。当慢性乙肝患者的肝细胞发生弥漫性坏死、肝脏出现纤维性增生，则基本上可判断进入早期肝硬化，随着肝硬化的病程进展，若不及时治疗，患者肝功能损害加重、胶原会明显增多，并于窦状间隙内各处过度沉积，并演变成毛细血管，发生大量物质交换，发生纤维化及结节状再生，极易发生癌变〔15〕。

血清HBV-DNA、ALT、AST、GGT和ALP的水平是常规实验室检测项目，多年来用于慢性乙肝、肝硬化和肝癌患者的临床诊断和治疗。本研究结果说明对于HBV-DNA水平一直较高的乙肝患者，在其明显下降的时候，一定要提防病程的进展，而肝硬化患者如果出现血清HBV-DNA水平的突然增高，要及时排除肝癌的可能。本研究结果发现ALT、AST、ALP、GGT等酶的改变对于判断慢性乙肝患者的疾病进程均有一定的辅助作用。焦娇等〔16〕指出，HBV-DNA水平及血清酶的改变是慢性乙肝和肝硬化患者发展为肝癌的危险因素。

miRNA属于一种调节基因表达关键的因子，可调节多个，乃至数百个靶基因，参与自身免疫疾病发生及发展过程，在机体免疫系统发育、免疫应答及自身免疫中起重要作用〔17〕。miRNA不仅会参与人体细胞生长和分化的生理过程，还可参与炎症及癌变等病理过程。研究证实，miRNA参与了肝细胞生长、病毒感染、应激反应及肝表型的维持等，可反映肝细胞及组织水平的基础生理状态，在肝癌的发生及发展中起到重要作用〔18〕。miR-146a会对炎性反应产生负反馈调节的作用，可监测自身免疫性疾病病情的活动性〔19〕。miR-375最早是在胰岛β细胞中被发现，其可调控胰岛素的形成及分泌，大量研究发现，miR375在肿瘤组织中会呈现低表达〔20〕。miR-21是一种研究最早也是较特殊的miRNA，在细胞增殖、分化及凋亡过程中发挥重要作用。研究显示，在消化系统肿瘤(胰腺癌、胃癌及肝癌等)中miR-21表达均上调〔21〕。本研究结果究其原因为miR-146a可诱导产生大量炎症因子，加重患者的炎症反应，使患者的肝脏受累程度加重。miR-21会诱导上皮间质转化，促进肝硬化发生，并可作为一种原癌基因，促进肝癌细胞的分化及生长，并增强其侵袭与转移，从而在肝癌患者体内的表达呈异常上调。

目前对肝癌的诊断主要通过影像学及病理检测，但难免存在较高的漏诊，尤其对早期肝癌的诊断率并不高。miRNA可通过形成脂蛋白复合物的形式抵抗RNA酶降解，可在血液中相对稳定存在，可通过反复提纯而检测到，减少入侵性的检查，其检测快捷、简单而有效，适合临床上对肝癌的早期筛查。本研究结果说明联合检测血清miR-375、miR-146a及miR-21表达情况，可作为肝癌，尤其对于乙肝肝硬化背景的肝癌的理想诊断标志物。