多指标综合评分法优化金银花枝叶的提取工艺研究

浙江省立同德医院 浙江 杭州 310012

金银花为忍冬科忍冬属植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花，具有清热解毒、消炎消肿、防癌抗癌、凉血止痢等医疗与保健功能[1]。有研究发现，绿原酸和异绿原酸以叶中的含量较高，而枝中咖啡酸含量高，不同时期的金银花修剪枝的各部位均含有黄酮，且都是节部和叶片含量最高，花中次之，茎含量较低。金银花枝叶中绿原酸和咖啡酸具有抗菌、抗病毒作用[2]。相比金银花，其枝叶的药用资源更为丰富，成本更为低廉。本实验希望明确金银花枝叶的提取工艺，有利于进一步研究其药理作用以及抗菌抑菌活性，为其合理利用提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器：岛津LC-20A vp高效液相色谱仪(日本岛津)；岛津 SPD-10A UV检测器（日本岛津）；METELLER电子分析天平(瑞士梅特勒)。UV-245紫外分光光度计（日本岛津）；METELLER电子分析天平(瑞士梅特勒)。

1.2 试剂：绿原酸对照品（批号：MUST-15082402，北京恒元启天化工技术研究院，北京世纪奥科生物技术有限公司联合研制）；芦丁对照品（批号：MUST-15092503，北京恒元启天化工技术研究院，北京世纪奥科生物技术有限公司联合研制）；乙腈为色谱纯，水为去离子水；其余均为分析纯或药用规格。

2 方法

2.1 单因素试验：将绿原酸和总黄酮含量作为评价指标，分别考察乙醇浓度、液料比、提取时间、提取次数对上述两种成分的影响情况，从而进一步开展金银花枝叶的正交优化试验。

2.2 正交试验法优化金银花枝叶提取工艺研究：在提取方法比较试验和单因素试验的基础上，采用回流法作为其最佳提取方法，考察乙醇浓度、液料比、提取时间、提取次数等4个因素，每因素取3个水平，作L9（34）正交试验设计。

2.3 绿原酸含量测定：分述如下。

2.3.1 色谱条件：资生堂Capcell Pak C18柱(4.6 mm×250mm，5μm)色谱柱；流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶87）；检测波长：327nm。

2.3.2 对照品溶液的制备：取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色瓶中，加50%甲醇制成每1ml含47μg的溶液，即得。

2.4 总黄酮含量测定：分述如下。

2.4.1 对照品溶液的制备：精密称取芦丁对照品10mg置50ml容量瓶中，加60%乙醇溶解并定容至50ml，制备浓度为0.2mg/ml的溶液。

2.4.2 标准曲线制备：分别精密吸取上述溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0ml于10ml容量瓶中，加入5%亚硝酸钠和10%硝酸铝各0.3ml，摇匀，放置6min，分别加入4%氢氧化钠4ml，用60%乙醇定容至刻度，摇匀，放置12min，在510nm处测定吸光度值。以吸光度为纵坐标(y），芦丁标准溶液浓度为横坐标（x），绘制标准曲线，得到回归方程为：y=0.0102x+0.0121，其中x为芦丁浓度，单位为mg/L，y为吸光度，R2=0.9989。

2.4.3 测定法：分别精密吸取上述不同液料比提取液各0.5ml至10ml容量瓶中，加入5%亚硝酸钠和10%硝酸铝各0.3ml，摇匀，放置6min，分别加入4%氢氧化钠4ml，用60%乙醇定容至刻度，摇匀，放置12min，在510nm处测定吸光度值。

2.5 正交试验优化金银花枝叶提取工艺：分别取金银花枝叶（粉碎过三号筛）1g，精密称定，按照上述L9(34）正交表进行正交试验，提取结束后，放冷，过滤，滤液分别用相应的乙醇溶液定容至100ml，备用，每个浓度各重复3次（n=3）。以绿原酸含量、总黄酮含量为指标，采用综合评分法，并以绿原酸含量最高为50分，依次类推；以总黄酮含量最高为50分，依次类推。通过正交试验表统计分析软件计算试验结果，确定最佳工艺。

3 结果

3.1 不同乙醇浓度对绿原酸、总黄酮含量的影响：取金银花枝叶5份（粉碎过三号筛），分别精密称取1g，按液料比14∶1分别加入乙醇浓度为25%、40%、55%、70%、85%的乙醇溶液，各提取2次，每次1.5h，提取结束后，放冷，过滤，滤液分别用25%、40%、55%、70%、85%的乙醇定容至100ml，备用，每个浓度各重复3次（n=3）。精密吸取2.3.2项下绿原酸对照品溶液，不同乙醇浓度供试品溶液各5μl，注入液相色谱中，按上述色谱条件测定峰面积，测定绿原酸含量。总黄酮按照2.4.3项下测定方法测定，结果见图1。

图1 乙醇浓度对绿原酸和总黄酮含量的影响

3.2 不同液料比对绿原酸、总黄酮含量的影响：取金银花枝叶5份（粉碎过三号筛），分别精密称取1g，按液料比6：1、10：1、14：1、18：1分别加入乙醇浓度为70%的乙醇溶液，各提取2次，每次1.5h，提取结束后，放冷，过滤，滤液分别用70%的乙醇定容至100ml，备用，每个液料比各重复3次（n=3）。精密吸取2.3.2项下绿原酸对照品溶液，不同液料比供试品溶液各5μl，注入液相色谱中，按上述色谱条件测定峰面积，测定绿原酸含量。总黄酮按照2.4.3项下测定方法测定，结果见图2。

图2 液料比对绿原酸和总黄酮含量的影响

3.3 提取时间对绿原酸、总黄酮含量的影响：取金银花枝叶5份（粉碎过三号筛），分别精密称取1g，按液料比14：1分别加入浓度为70%的乙醇溶液，分别提取2次，每次0.5、1.0、1.5、2.0h，提取结束后，放冷，过滤，滤液分别用70%的乙醇定容至100ml，备用，每个不同提取时间各重复3次（n=3）。精密吸取2.3.2项下绿原酸对照品溶液，不同提取时间供试品溶液各5μl，注入液相色谱中，按上述色谱条件测定峰面积，测定绿原酸含量。总黄酮按照2.4.3项下测定方法测定，结果见图3。

图3 提取时间对绿原酸和总黄酮含量的影响

3.4 提取次数对绿原酸、总黄酮含量的影响：取金银花枝叶5份（粉碎过三号筛），分别精密称取1g，按液料比14：1分别加入浓度为70%的乙醇溶液，分别提取1、2、3、4次，每次1.5h，提取结束后，放冷，过滤，滤液分别用70%的乙醇定容至100ml，备用，每个不同提取次数试验各重复3次（n=3），精密吸取2.3.2项下绿原酸对照品溶液，不同提取时间供试品溶液各5μl，注入液相色谱中，按上述色谱条件测定峰面积，测定绿原酸含量。总黄酮按照2.4.3项下测定方法测定，结果见图4。

图4 提取次数对绿原酸和总黄酮含量的影响

3.5 正交试验结果：由极差分析、方差分析结果显示：因素影响乙醇浓度＞液料比＞提取时间＞提取次数。最终确定最佳提取工艺为按液料比14：1加入70%浓度的乙醇溶液，分2次提取，每次提取1.5h。按照正交试验优化所得最佳提取工艺，重复3次作为验证试验，结果绿原酸含量分别为2.09%、2.11%、2.08%；总黄酮含量分别为8.02%、8.06%、8.05%，高于正交试验中的绿原酸和总黄酮含量，证明此方法确实可行。

4 讨论

本实验是在单因素考察的基础上，确定正交试验条件，再进一步明确金银花枝叶提取工艺。单因素试验结果显示在一定范围内，随着乙醇浓度的提高，金银花枝叶中绿原酸的提取量和总黄酮提取率均显著增加，当乙醇浓度超过70%时，二者均降低，这可能是过高的有机溶剂浓度导致细胞膜变性，通透性降低，阻碍了绿原酸的溶出，同时高浓度的乙醇限制了某些黄酮类物质的溶出。当液料比大于14：1时，绿原酸提取量反而呈下降趋势，总黄酮的提取率基本没什么变化，考虑到溶剂用量及下一步浓缩工艺的负荷，选择14：1比较合理。绿原酸的提取量和总黄酮提取率随时间的延长相应增加，在1.5h左右，绿原酸的提取量趋于平衡，可能因为时间的过度延长会导致杂质成分的溶解也随之增加；总黄酮提取率反而有所下降，可能由于黄酮长时间暴露，部分被氧化。随着提取次数的增加，绿原酸的含量有所增加，但当提取次数超过2次后增加不是很明显；总黄酮含量2次提取量比1次略高，但和3次、4次比较没差异，考虑能耗和提取效率，选择2次比较合理。