大孔树脂对短梗五加多酚的纯化效果及多酚的抗疲劳作用研究

刘 琦

（南昌理工学院体育学院，江西 南昌 330044）

短梗五加（Acanthopanax sessiliflorus）为伞形目五加科五加属植物，富含多糖、氨基酸、花色苷、槲皮素、绿原酸、酚酸等化合物[1-2]，因其具有益气安神、活血通络等功效而被加工成各类食品或药品使用。近年来有研究发现，其果实中多酚具有抗氧化、降血糖及增强机体免疫功能等活性[3-5]。肖凤艳等[6]采取减压回流提取该植物果实中多酚，发现其具有较好的抗疲劳效果。但一般提取物中仍含有较多鞣质、蛋白质等杂质，使得多酚含量偏低，进而影响产品的功效。

大孔树脂吸附分离综合了机械筛分与化学吸附的优点，具有选择性高、干扰因素少、可重复循环利用等特点，被广泛用于天然产物活性成分的分离和纯化[7-8]。本研究在短梗五加果多酚提取研究的基础上，探讨大孔树脂纯化短梗五加多酚提取物的最佳工艺条件，同时研究其对运动后小鼠的抗疲劳作用效果，为短梗五加多酚的进一步开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

短梗五加果：采购于辽宁建联医药连锁有限公司；绿原酸：定量分析用，中国药品生物制品检定所产品；乙醇、甲醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司产品；AB-8、DM-130 大孔树脂：天津浩聚树脂科技有限公司产品；H-103、D-101 大孔树脂：沧州宝恩吸附材料科技有限公司产品；NKA-9、ADS-21 大孔树脂：天津西金纳环保材料科技有限公司产品；血尿素氮（BUN）试剂盒、乳酸（BLA）检测试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂、肌糖原（MG）和肝糖原（HG）试剂盒：南京建成生物工程研究所产品。试验用水为超纯水。

试验动物：健康雄性小鼠 30 只，体重（7±2）g，由江西省实验动物中心提供，生长环境温度20～25 ℃，相对湿度50%～70%。

1.1.2 仪器与设备

T6 型紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司产品；FA2204B 型电子天平：上海精密科学仪器有限公司产品；878-B 型多功能粉碎机：常州国华电器有限公司产品；RE-6000AT 型旋转蒸发仪：杭州振和科学仪器有限公司产品；SCIENTZ-10ND型冷冻干燥机：宁波新芝生物科技股份有限公司产品；KL-211D 型恒温振荡器：上海凯朗仪器设备有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 提取物的制备

干燥的短梗五加果粉碎后，过80 目筛，称取50 g，加入750 mL 50%乙醇溶液，80 ℃回流提取60 min 后过滤，提取两次，合并滤液减压回收乙醇后，冷冻干燥备用[6]。

1.2.2 定量分析

1.2.2.1 多酚标准曲线的绘制

不同产物的多酚含量以绿原酸当量表示，准确称取10.0 mg 绿原酸标准品，以甲醇溶解定容至50 mL容量瓶后，分别准确移取 1、2、5、10、15 mL 标准品溶液置于50 mL 容量瓶内，另加入5%亚硝酸钠溶液2.0 mL，静置6 min 后再加入10%硝酸铝溶液2.0 mL，混匀后，静置6 min，再加入4%氢氧化钠溶液8.0 mL，静置 15 min，加水定容，即得 0.004 ～ 0.06 mg/mL 绿原酸标准溶液，然后于520 nm 波长处测定吸光度值，绘制标准曲线[9]，得到线性方程为：y=11.253x+0.015 2（R2=0.999 5，y为吸光度，x为浓度值）。

1.2.2.2 多酚含量的测定

提取物和纯化物样品多酚含量测定：准确称取样品10.0 mg，采用甲醇溶解，并定容至50 mL 容量瓶后，准确移取20 mL 溶液至50 mL 容量瓶内，加入显色剂后，加水定容至50 mL，于520 nm 波长处测定吸光度，代入标准曲线，计算得到样品多酚含量，平行测定 3 次。

静态吸附液和动态流出液中多酚含量测定：使用旋转蒸发仪去除静态吸附液与动态流出液中的乙醇，后冷冻干燥，按照上述步骤加入显色剂后，于520 nm波长处测定吸光度值，根据标准曲线方程，计算样品的多酚含量，平行测定3 次。

1.2.3 树脂预处理

将大孔树脂于90%乙醇中浸泡24 h，充分溶胀后湿法装柱，然后用90%乙醇反复冲洗，直至流出液与水混合（V液∶V水=1∶5)无白色浑浊出现，再用水洗至无乙醇气味，加入3%盐酸浸泡3 h，用水洗至中性；再用3%氢氧化钠溶液浸泡3 h，用水洗至中性，备用[10]。

1.2.4 大孔树脂的型号筛选

准确称取一定质量的粗提物溶解至无水乙醇中，配制成0.1 mg/mL 吸附液。准确称取10.0 g 六种不同极性的大孔树脂（H-103、D-101、DM-130、AB-8、NKA-9、ADS-21）置于锥形瓶内，分别加入100 mL 吸附液后，置于恒温振荡器内，静态吸附24 h 后过滤。通过下式计算不同类型大孔树脂的静态吸附量与吸附率[11]。

式中：Γe为树脂的吸附量，mg/g；m0为吸附液中多酚质量，mg；me为吸附后滤液中多酚质量，mg；m为干燥的大孔树脂质量，g；Qe为吸附率，%。

利用乙醇溶液作解吸剂，将吸附后的树脂过滤，用一定量水洗至无提取液残留后，置于锥形瓶内，加入70%乙醇100 mL 后，置于恒温振荡器中，静态解吸24 h，过滤，测定滤液中多酚的含量，通过下式计算不同类型树脂的解吸率与回收率[12]。

式中：Dd为解吸率（%）；md为解吸液中多酚质量（mg）；m0为原吸附液中多酚质量（mg）；me为吸附后滤液中多酚质量（mg）；R为回收率（%）。

1.2.5 不同吸附条件对树脂动态吸附率的影响

以50 mL 乙醇为溶剂配制不同浓度的吸附液。根据预试验结果，取5 g 已处理后的AB-8 大孔树脂湿法装柱后，分别考察上样液浓度、上样液pH 和上样流速对树脂的吸附率影响，具体如下：（1）当上样液浓度0.3 mg/mL，上样液pH 为4 时，上样流速分别为：1、2、3、4、5 mL/min；（2）当上样液浓度 0.3 mg/mL，上样流速为 2 mL/min 时，上样液 pH 分别为：2、3、4、5、6；（3）当上样液pH 为4，上样流速为2 mL/min 时，上样液浓度分别为：0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL。吸附完成后，测定流出液中多酚含量，计算树脂吸附率。

1.2.6 不同洗脱条件对洗脱率的影响

以乙醇溶液作洗脱剂，分别考察洗脱液浓度、洗脱流速与洗脱液体积对多酚化合物洗脱率的影响，具体如下：（1）当洗脱流速为1 mL/min、洗脱液体积为100 mL 时，洗脱液浓度分别为 50%、60%、70%、80%、90%；（2）当洗脱液浓度为70%、洗脱流速为1 mL/min时，洗脱液体积分别为 80、90、100、110、120 mL；（3）当洗脱液浓度为70%、洗脱液体积为100 mL 时，洗脱流速分别为 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL/min。洗脱完成后，测定流出液中多酚含量，计算洗脱率（洗脱的多酚占被吸附的多酚的百分比）。

1.2.7 抗疲劳试验

1.2.7.1 试验设计

30 只健康雄性小鼠，随机分为3 组，每组10 只，分别为对照组、提取组和纯化组，向提取组和纯化组的饲料内掺入等量的多酚提取物和纯化物，每天喂食2 次，连续喂食30 d。每组小鼠每次喂食1 h 后于恒温游泳池内开展游泳训练，5 d 为一训练周期，共训练4周，空白对照组采用等量生理盐水灌胃[13]。

1.2.7.2 小鼠负重游泳时间

第30 天，喂食结束1 h 后于鼠尾负重自身5%的重物，进行力竭性游泳试验，记录小鼠自入水开始游泳至沉没超过10 s 的时间，即为游泳力竭时间[14]。

1.2.7.3 生化指标检测

小鼠游泳运动进行10 min 后，取出擦净，摘取眼球，抽血离心，收集血清，同时分取肝与肌肉组织，利用相关试剂盒，分别测定不同组别小鼠肝脏中肝糖原含量、肌肉中肌糖原含量和血清中乳酸浓度、丙二醛含量、尿素氮含量与乳酸脱氢酶活力。

1.2.8 数据处理

相关评价指标均采用均数、标准差描述，利用SPSS 19.0 进行方差分析，检验水准α=0.05，当P＜0.05表示具有显著性差异，P＜0.01 表示具有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂的选择

表1 为不同类型树脂的静态吸附与解吸性能比较。由表1 可见，弱极性树脂对多酚化合物表现出较好的纯化效果，特别是AB-8 大孔树脂的静态吸附回收率远高于其他五类树脂，达到80.47%，这归因于多酚化学结构上的羟基具有一定的极性，使得AB-8 大孔树脂能够与其产生较好的吸附作用[15]，因此确定采用AB-8 作为纯化短梗五加多酚的吸附树脂。

表1 不同树脂的静态吸附与解吸性能比较Table 1 Comparison of static adsorption and desorption performance of different macroporous resins

AB-8 大孔树脂的静态吸附曲线如图1 所示。随着吸附时间的增长，AB-8 大孔树脂对短梗五加多酚的吸附率不断升高，在吸附6 h 后趋于平衡。

2.2 AB-8 纯化效果的单因素试验

2.2.1 上样液浓度对短梗五加多酚吸附率的影响

上样液浓度过高可能会造成吸附不完全，上样液浓度过低，分离纯化耗时会过长，影响试验效率。不同上样液浓度对短梗五加多酚吸附率的影响如图2所示。随着上样液浓度的增大，AB-8 大孔树脂对短梗五加多酚的吸附率缓慢降低；当上样液浓度为0.4 mg/mL 时，吸附率明显下降。综合考虑，确定上样液浓度以0.1 mg/mL 为宜。

2.2.2 上样液pH 对短梗五加多酚吸附率的影响

不同上样液的pH 对吸附率的影响如图3 所示。随着上样液pH 的增大，AB-8 大孔树脂对短梗五加多酚的吸附率先增高后降低，当pH 为4 时达到最大值，这源于短梗五加多酚的化学结构中含有酚羟基，呈弱酸性，而上样液在弱酸性时可降低其溶解性从而易于吸附[16]。因此，确定上样液pH 以4 为宜。

2.2.3 上样流速对短梗五加多酚吸附率的影响

在动态吸附时，上样流速过快，目标物与树脂接触不充分，可能造成过早泄漏；但流速过慢，又导致耗时过长，且对后续树脂再生产生不良影响。不同上样流速对吸附率的影响如图4 所示。随着上样流速的增大，AB-8 大孔树脂对短梗五加多酚的吸附率呈下降趋势。综合考虑吸附效率，本研究确定上样流速2 mL/min 为宜。

2.2.4 洗脱液浓度对短梗五加多酚洗脱率的影响

不同浓度的乙醇对短梗五加多酚的洗脱效果如图5 所示。随着洗脱液浓度的增大，洗脱率逐渐增大；当洗脱液浓度为70%时，洗脱率开始下降。这可能是因为低浓度乙醇无法使得多酚类化合物充分溶出，洗脱不充分，而高浓度乙醇的极性与多酚相差较大，不利于洗脱[17]。因此确定洗脱液以70%的乙醇较为适宜。

2.2.5 洗脱流速对短梗五加多酚洗脱率的影响

不同洗脱流速对短梗五加多酚的洗脱率影响如图6 所示。随着洗脱流速的增大，洗脱率逐渐下降，这归因于流速较快时，洗脱液不能充分接触树脂，但流速过低，又会延长洗脱过程。因此确定洗脱流速1.0 mL/min 较为适宜。

2.2.6 洗脱液体积对短梗五加多酚洗脱率的影响

不同洗脱液体积对短梗五加多酚的洗脱率影响如图7 所示。当洗脱液用量达到100 mL 时，洗脱率趋于平衡，表明树脂吸附的多酚基本被洗脱。因此确定洗脱液体积100 mL 较为适宜。

2.3 最佳工艺验证

采取上述条件纯化短梗五加提取物中多酚，即配制浓度为 0.1 mg/mL、pH = 4 的上样液 50mL，以2 mL/min 流速上样至5 g AB-8 型大孔树脂中进行吸附。采用体积为100 mL、浓度70%的乙醇溶液，以1 mL/min 流速洗脱，测得吸附率为90.35%，洗脱率为89.87%。纯化前后产物的多酚含量如表2 所示。产物的多酚含量由纯化前的124.53 mg/g 提高至纯化后的279.73 mg/g，约提高 2.25 倍。

2.4 不同组别小鼠的游泳力竭时间比较

负重游泳时间的长短直接反映运动过程的抗疲劳程度[18]。不同产物对小鼠的负重游泳时间影响如图8 所示。由图8 可知，与对照组相比，提取组与纯化组小鼠的负重游泳时间均极显著延长（P＜0.01），表明短梗五加多酚能够提高小鼠的运动耐力；而纯化组小鼠的游泳时间较提取组明显增长，差异具有显著性（P＜0.05），表明纯化产物有助于更好地增强小鼠的运动耐力。

2.5 不同物质对小鼠的血乳酸浓度和乳酸脱氢酶活力的影响

身体运动后乳酸的浓度水平与疲劳程度呈正相关，机体高强度运动后会造成体内部分细胞缺氧，致使血糖发生糖酵解生成乳酸，蓄积在骨骼肌等组织中，而乳酸脱氢酶可迅速催化乳酸脱氢形成丙酮酸，有利于排泄出体外[19]。不同产物对运动后小鼠的体内乳酸生化指标影响见图9。与对照组相比，提取组与纯化组小鼠运动后血乳酸生成量明显偏低，且体内乳酸脱氢酶活力极显著增强（P＜0.01）；同时纯化组小鼠体内的血乳酸含量和乳酸脱氢酶酶活力与提取组小鼠之间呈极显著差异（P＜0.01），从而表明短梗五加多酚的纯化产物具有良好的开发利用价值。

2.6 不同物质对小鼠的肝糖原和肌糖原含量的影响

肝糖原与肌糖原是机体的重要储能物质，当机体开始运动时，肌糖原逐渐消耗至殆尽，随后利用肝糖原以维持体内运动时血糖水平。由图10 可以看出，提取组与纯化组的两种糖原含量均极显著高于对照组（P＜0.01），而纯化组体内的两种糖原含量明显更高，从而表明短梗五加纯化产物有助于明显增加体内肝糖原与肌糖原的储备，进而更好地发挥抗疲劳作用。

2.7 不同物质对小鼠的尿素氮和丙二醛含量的影响

机体的剧烈运动会增加体内蛋白质的分解代谢，使得代谢产物尿素氮从肾脏经血液循环排出体外，相关研究已证明体内尿素氮含量与机体的疲劳程度呈正相关[20]。由图11 可知，提取组和纯化组动物运动时，体内尿素氮含量均极显著低于对照组（P＜0.01）；同时，运动后肝脏生成的丙二醛具有细胞毒性，可使蛋白质与核酸产生交联聚合[21]，而提取组和纯化组小鼠的肝脏丙二醛浓度均极显著低于对照组（P＜0.01）。综上结果表明，短梗五加纯化产物可有效降低运动时蛋白质的代谢和丙二醛的生成速率。

3 结论

本研究采用AB-8 大孔树脂纯化短梗五加提取物中的多酚，利用单因素试验得到最佳纯化工艺条件：配制浓度为0.1 mg/mL、pH=4 的上样液50 mL，以2 mL/min 流速上样至5 g AB-8 型大孔树脂中进行吸附，采用70 %乙醇溶液100 mL，以1 mL/min流速洗脱，树脂对多酚的吸附率和洗脱率分别为90.35%、89.87%。产物的多酚含量由纯化前的124.53 mg/g 提高至纯化后的279.73 mg/g，约提高2.25 倍。该工艺操作简便、纯化效率较高，且产物可显著延长小鼠的游泳力竭时间，显著增加体内肝糖原、肌糖原含量和乳酸脱氢酶活力，并有效降低尿素氮、丙二醛和乳酸浓度水平，从而具有较好的抗疲劳作用。本研究可为短梗五加多酚化合物的进一步开发提供参考。