三种方法评估替加环素对多重耐药鲍曼不动杆菌体外药敏结果分析

代鑫露，黄松音，李红玉

（中山大学孙逸仙纪念医院检验科，广州 510120）

随着抗生素的广泛使用，多重耐药鲍曼不动杆菌（multidrug resistantAcinetobacter baumannii，MDR-AB）日趋增多，给临床抗感染治疗带来严峻挑战[1]。替加环素是目前为数不多的针对多重耐药鲍曼不动杆菌的抗生素之一，然而各地区敏感性差异大，不同药敏方法也存在差异，目前美国临床实验室标准化研究所（CLSI）仍无替加环素对鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii，AB)的药敏折点标准[2]。本研究是以MIC test strip 法（以下简称MTS 法）为参考，分析比较替加环素不同药敏方法对MDR-AB 药敏结果的影响。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 60 株耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌菌株分离自2018年中山大学孙逸仙纪念医院住院病人临床标本，药物敏感试验质控菌株为大肠埃希菌（ATCC25922）。

1.2 主要试剂和仪器 替加环素药敏纸片（15 μg）购自英国OXOID 公司，替加环素MIC test Strip 试纸条（MTS，0.016～256 μg /ml）购自意大利Liofichem 公司，MH 琼脂培养基、VITEK-2 全自动微生物分析仪及配套鉴定和药敏卡均为法国梅里埃产品。

1.3 实验方法

1.3.1 VITEK-2 法：使用VITEK-2 全自动微生物分析仪及配套GN 卡鉴定细菌和AST-GN16 药敏卡进行药敏试验[3]。

1.3.2 纸片扩散法：根据CLSI 推荐操作，取0.5麦氏浊度单位的菌液均匀涂布于MH 琼脂培养基上[4]，室温放置15 min 待表面干燥后将纸片替加环素药敏纸片贴于培养基表面，35 ℃孵育箱培养16～18 h，用游标卡尺量取完整抑菌圈直径。

1.3.3 MTS 法：操作同纸片扩散法，将纸片换做MTS 试纸条贴于培养基中央，有刻度的一面朝上，读取结果判断：读取椭圆型抑菌圈与试纸条的交界处刻度，即最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）[5]。

1.4 数据分析 由于CLSI 标准中还没有替加环素体外药敏试验检测的操作指南和结果判定标准，因此参照美国食品药品监督局（FDA）推荐折点进行判读。MIC≤2 mg/L为敏感（S），4 mg/L为中介（I），≥8 mg/L 为耐药（R）。将MTS 法作为参考方法比较Vitek-2 法、纸片扩散法与MTS 方法的一致性。分类一致性（caregorical agreement，CA）定义为被评估方法与MTS 法药敏结果判断一致的菌株百分比。非常重大误差（very major error，VME）定义为被评估方法将耐药误判为敏感，重大误差（major error，ME）定义为被评估方法将敏感误判为耐药，小误差（minor error，mE）定义为被评估方法将中介报告为耐药或敏感[6]。可接受的误差范围为：CA ≥90%，VME ≤1.5%，ME ≤3%，mE ≤10%。

2 结果

2.1 三种方法测定替加环素对MDR-AB 的药敏结果及MIC 值分布 参照FDA 判断标准MTS 法对多重耐药鲍曼不动杆菌的敏感率为1.7%（1/60），中介率为75.0%（45/60），耐药率为23.3%（14/60），MIC50 为6mg/L, MIC90 为8mg/L。Vitek-2 法敏感率为26.7%（16/60），中介率为65.0%(39/60)，耐药率为8.3%（5/60），MIC50 为4mg/L，MIC90 为4mg/L。纸片扩散法敏感率为1.7%（1/60），中介率为13.3%（8/60），耐药率为85.0%（51/60）。

2.2 MTS 法与Vitek-2 法的MIC 结果比较 见表1。按照FDA 标准，Vitek-2 法的MIC 值较MTS 法低1 ～3 个稀释度，易造成假敏感或假中介。

表1 MTS 法与Vitek-2 法的MIC 结果比较[株（%）]

2.3 两种方法与MTS 法测定结果比较 见表2。以MTS 法为参考，将其他两种方法与之比较，按FDA 标准，Vitek-2 法和纸片扩散法的CA 均＜90%，mE 均＞10%，纸片扩散法ME 为1.7%，Vitek-2 法的VME 为1.7%，提示Vitek-2 法和纸片扩散法不适合检测替加环素的敏感性。

表2 MTS 法与其他2 种方法检测结果比较 ［株（%）］

3 讨论

替加环素是一种新上市的广谱抗生素，它能有效治疗碳青霉烯耐药菌株及多种复杂耐药菌株[7-8]。然而近些年却出现了对替加环素不敏感菌株，甚至在一些没有使用替加环素的地区也出现了耐药，其耐药性的发生、发展可能与这些抗生素的选择性压力有关[9-10]。目前，针对替加环素体外药敏试验，不同方法、不同判定折点间存在较大的差异。因此，本研究对临床MDR-AB 用不同检测方法检测替加环素的药敏结果进行比较，为本地区替加环素的体外药敏试验提供参考依据。

目前肉汤稀释法被认为是检测替加环素敏感性的金标准[1]，但该方法操作繁琐，不适宜临床大规模检测。Vitek-2 由于自动化、高通量，广泛应用于临床对细菌的鉴定和药敏实验。但是多项研究显示Vitek-2 的鉴定效果存在一定的误差[11-12]。熊安英等[13]评估了Vitek-2 系统对肺炎链球菌的药敏诊断价值，与MTS 法相比，二者对青霉素MIC 在0.06～1.00 mg/L 的CA 为100%，但当MIC＞2.00 mg/L 时，CA 仅为46.0%，出现了较多的假敏感和中介现象。同样的，黄晓春等[14]以微量肉汤法为标准，发现Vitek-2 检测鲍曼不动杆菌对阿米卡星的敏感度出现了50% 的重大误差，提示Vitek-2 在检测鲍曼不动杆菌对阿米卡星的敏感性时有局限性。本研究结果显示，Vitek-2 法检测的敏感率为26.7%，但MTS 法仅为1.7%，同时Vitek-2 测得的替加环素对MDR-AB 的MIC 值较MTS 低1～2 个稀释度，出现了较多的假敏感，提示其对于检测替加环素的MIC 值有限。分析其原因，可能与Vitek-2 的检测原理有关，Vitek-2 是通过检测3～4 个抗生素浓度进而预测出细菌6 个不同的生长模式，最终提供6 个MIC 值，但这3～4 个抗生素浓度可能并不是菌株的生长折点，因此可能会出现假敏感现象，另外由于Vitek-2 采用光电比浊法进行药敏检测，结果会存在拖尾现象，易将中介或耐药误报为敏感或中介。这些都有可能使Vitek-2法的检测结果出现一定误差。

纸片扩散法操作简便且成本较低，但易受多种因素的影响，如接种量、抗生素含量、琼脂厚度等[15]。潘楚芝等[16]比较了纸片扩散法和微量肉汤稀释法检测MDR-AB 对替加环素的敏感性，发现二者存在较大差异，该研究认为差异原因可能与纸片扩散法检测肠杆菌科细菌不同的折点标准有关，并推荐当抑菌环直径＞12 mm 时判定为敏感。而目前常用的3种标准（美国FDA推荐标准、Jones法、Kulah法）判定敏感的标准均＞16 mm。本研究结果表明，纸片扩散法对MDR-AB 的耐药率、中介率上升，敏感率下降。mE 为61.6%，超出了可接受范围，CA仅为36.7%，一致率较低，但多数菌株为MTS 法敏感而纸片扩散法中介或MTS 法中介而纸片扩散法耐药，未出现MTS 法耐药而纸片扩散法敏感的结果。有国内外研究[17-18]报道纸片扩散法可能高估了替加环素的中介率和耐药率，本文出现的mE 为61.6%可能与此有关。

综上所述，对于多重耐药鲍曼不动杆菌，Vitek-2 法和纸片扩散法均不适合检测替加环素的敏感度，Vitek-2 法和纸片扩散法测定的中介和耐药菌株仍需要用MTS 法确认。本研究的菌株来源同一家医院且样本量少，仍需多中心大样本的研究证实。