利用制备液相色谱系统分离中药槐花米中的芦丁

彭毓敏 ，朱 峰 ，周 炎 ，古世阳

（1.广东省中西医结合医院药物调配中心，广东佛山528200；2.佛山科学技术学院环境与化学工程学院，广东佛山528000；3.佛山科学技术学院佛山市活性天然产物与功能化学品工程技术研究中心，广东佛山528000）

芦丁具有多种生物活性［1-3］，比如抗氧化、降血压、抗癌等，受到人们的广泛重视。为了揭示其作用机理，近年来研究者们运用新技术对其结构进行研究，特别是Samsonowicz等发现，当芦丁与碱金属离子结合后，其抗氧化能力和抗微生物活性均显著增强［3-4］。芦丁存在于罗布麻［5］和文冠果叶［6］中，在槐花米中的含量较高，槐花米是制取芦丁的重要中药资源。现有不同的方法均是利用高效液相色谱技术测定槐花米中芦丁的含量［7-10］，未见利用制备液相色谱技术从槐花米中制取高纯度芦丁的方法。本研究开发一种利用制备液相色谱系统从槐花米中分离制备芦丁的快速方法，并利用NMR技术对其结构进行表征，为槐花米中高纯度芦丁的制备提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

（1）仪器。Prep 150 LC制备液相色谱系统（美国Waters），RV8型旋转蒸发仪（德国IKA），ETF-60无液氦核磁共振波谱仪（美国Anasazi）。

（2）试剂。槐花米（市售），甲醇（分析纯），乙酸（分析纯），超纯水。

1.2 槐花米中芦丁的提取

采用甲醇连续渗漉回流提取槐花米中的芦丁。称取10 g槐花米粉末装入125 mL筒形恒压漏斗，压实后盖上一层脱脂棉，安装到已放入沸石的250 mL圆底烧瓶上。从恒压漏斗上口加入150 mL甲醇经槐花米粉末渗漉到圆底烧瓶中，保持甲醇液面高于槐花米粉末，关上恒压漏斗旋塞。安装好球形冷凝管，接通冷却水，用90℃恒温水浴加热回流。待有回流液滴入恒压漏斗时，旋开漏斗旋塞，保持渗漉液滴入烧瓶中的液滴速度和回流速度一致。连续渗漉回流提取60 min。甲醇提取液在50℃真空旋转蒸发回收甲醇得浸膏，然后用150 mL沸水溶解浸膏，趁热过滤至250 mL烧杯中，待冷却至室温后置于4℃冰箱中冷却60 min，析出大量黄色沉淀，抽滤，沉淀用冰水洗涤后，置于105℃烘箱中烘干，得到粗芦丁2.11 g，提取率21.1%。

1.3 粗芦丁的分离纯化

1.3.1 样品溶液的准备

称取0.5 g粗芦丁用75 mL体积分数为70%甲醇水溶液加热溶解，用普通滤纸过滤，滤液冷却后再过0.45 μm滤膜，得到粗芦丁样品溶液。

1.3.2 制备液相色谱条件

（1）制备液相色谱系统。配有2545二元梯度模块的Prep 150 LC系统、5 mL定量环的Waters自动进样器、2489紫外可见光检测器、Waters馏分收集器III及ChromScope软件。

1.3.3 芦丁的结构鉴定

将分离纯化得到的芦丁馏分通过50℃真空旋转蒸发浓缩至体积一半，析出大量沉淀，进一步置于4℃冰箱冷却30 min，抽滤，沉淀用冰水洗涤后置于90℃烘箱中烘干，得到淡黄色芦丁产品。取约20 mg芦丁产品用氘代二甲基亚砜（DMSO-d6）溶解后，进行核磁共振波谱分析。

2 结果与讨论

2.1 槐花米中芦丁的提取

大多数文献均采用碱溶酸沉法从槐花米中提取芦丁［11］。笔者在实践中发现，通过碱溶酸沉法提取，要用到多种试剂，比如熟石灰、硼砂和盐酸，且操作繁琐，耗时较长。特别是如果酸化步骤没能控制好pH值，容易导致析不出芦丁沉淀或析出不完全。本文根据芦丁在甲醇中的溶解性较好的特点，采用甲醇连续回流渗漉提取，既减少了试剂品种和操作步骤，又提高了芦丁提取率，粗芦丁提取率达21.1%。另外，甲醇回收后还可以重复利用，既节省了提取成本，又避免了环境污染。

2.2 粗芦丁的分离纯化

芦丁是黄酮苷类化合物，含有多个酚羟基，有一定酸性，在液相色谱分离中易产生拖尾现象，使用酸性水溶液为流动相可以有效避免这一现象。本文选择0.2%乙酸水溶液为流动相A。根据芦丁和槐花米中其他成分（槲皮素、染料木素等）的紫外吸收特点，结合文献相关方法，设置紫外检测波长为360 nm。由于Prep 150 LC系统的耐压局限性，流速太高，会超出系统耐压范围；流速太低，又会导致分离时间较长，设置流速为10 mL/min。在本文样品浓度下，进样量太高（5 mL），会导致芦丁分离峰出现平头现象；进样量少，虽然可以避免这一现象，但需要分离的实验次数增多，既耗时又耗流动相。试验后发现，进样量为2.5 mL是合适的。在流动相组成条件摸索中发现，甲醇含量低，芦丁保留时间相应延长，如果甲醇含量高，则部分杂质会和芦丁分离峰部分重叠，达不到好的分离效果。经多次实验摸索后发现，当流动相组成为45%A和55%B时，可以有效实现芦丁的分离纯化，如图1所示。

图1 槐花米中粗芦丁的液相色谱

分析图1可知，粗芦丁样品含有3个主要成分。根据文献［7，9］推测，含量最大的峰1（保留时间7.94 min）可能是芦丁，而含量较低的峰2（保留时间10.80 min）和峰3（保留时间18.99 min）可能为槲皮素和染料木素。由于峰3保留时间较长，为18.99 min，如果等到峰3完全跑完，耗时较长，也比较耗流动相。继续分析发现，如果不等到第1针样品的峰3跑完，在第1针样品运行至15 min时就进入第2针样品，那么在相同洗脱条件下，第1针样品未跑完的峰3则会出现在第2针样品的峰1前面。实际实验结果证实了这一设想，如图2所示。因此，设置自动进样程序在前一针进样后15 min自动进入第2针样品。这样既可以节省分离纯化时间，又可以节省流动相用量。

进一步分析图1和2可以发现，粗芦丁样品中峰2和峰3的丰度均低于250 mAU，而峰1的丰度则远远大于250 mAU。因此设置馏分自动收集方法按丰度收集，当在运行7～9 min内收集丰度大于250 mAU的馏分，这样可以收集得到纯净的峰1组分。在相同色谱条件下用同一Prep 150 LC系统分析收集得到的馏分，进样量为0.5 mL，得到液相色谱如图3所示。图3显示只有1个芦丁色谱峰而没有杂质峰，表明已实现高纯度芦丁的分离制备。

图2 槐花米中粗芦丁的制备液相色谱

图3 槐花米中纯芦丁的液相色谱

2.3 芦丁的结构鉴定

从峰1馏分得到的产品，其1H NMR谱如图4所示。

图4 芦丁的1H NMR谱（60 MHz，溶剂DMSO-d6）

由图4可知，在δ12.61（s，1H）、10.81（br s，1H）、9.66（br s，1H）和9.17（br s，1H）显示4个酚羟基质子信号，在δ7.59（m，2H）、6.86（d，1H）、6.40（s，1H）和6.21（s，1H）给出5个芳香质子信号，在δ5.5～3.0给出多个连氧饱和碳氢信号，δ3.21的质子信号与δ3.39的水峰信号重叠在一起，还显示1个甲基信号在δ1.01（d,3H），而δ2.50的信号是DMSO-d6的溶剂峰信号。

另外，13CNMR谱如图5所示。

图5 芦丁的13C NMR 谱（15.125 MHz，DMSO-d6）

图5给出27个碳信号，其中1个羰基碳信号在δ176.90，14个芳香碳和2个缩醛碳信号则分别在δ163.50、160.67、156.26、155.99、147.83、144.26、132.76、120.83、120.55、115.74、114.71、103.40、100.68、100.27、98.13和93.20，9 个连氧饱和碳信号则在δ75.88、75.32、73.60、71.39、71.23、69.95、69.59、67.62和66.31，1个甲基碳信号在δ17.14。1H NMR谱和13C NMR谱信号特征均符合芦丁化学结构式的特点，如图6所示，并与文献［5，6，12］中芦丁的数据基本一致。故可确认通过制备液相色谱从槐花米中分离得到的峰1馏分是目标产物芦丁。

图6 芦丁的化学结构式

3 结论

将传统的碱提酸沉法改用甲醇连续渗漉回流提取槐花米中的芦丁，可以减少操作步骤，提高提取效率，避免多种化学试剂特别是管控试剂盐酸的使用，且甲醇可以回收重复使用，降低了提取成本。

将粗芦丁按比例（0.5 g/75 mL）溶于70%甲醇水溶液后，使用Prep 150 LC制备液相色谱系统，制备分离色谱条件为SunFirePrep C18OBDTM色谱柱（5 μm，19 mm × 250 mm）、柱温为室温、流动相 A 为0.2%乙酸水溶液、流动相B为甲醇、流动相组成为45%A与55%B（等度洗脱）、流速为10 mL/min、进样量为2.5 mL、紫外检测波长为360 nm、设置运行时间15 min。采用连续自动进样，自动收集丰度大于250 mAU的馏分，可快速高效从粗芦丁中分离得到高纯度的芦丁产品。该产品化学结构得到NMR波谱确证。

总之，本文实验结果为利用Prep 150 LC制备液相色谱系统快速高效地从中药槐花米中制备分离高纯度的芦丁提供了一种值得推广的方法。