银杏叶黄酮实验室提取技术进展

摘 要：银杏叶黄酮已成为研究热点，而黄酮的实验室提取是分离纯化、结构鉴定和活性探究等的前提。目前，银杏叶黄酮实验室提取技术主要有传统的碱液提取、热水提取、有机溶剂提取和新兴的酶辅助提取、超临界流体提取、超声波辅助提取、微波辅助提取等。本文对银杏叶黄酮的实验室提取技术进行了归纳总结和评价，并在此基础上进行了展望，以期为银杏叶黄酮的进一步开发提供借鉴。

关键词：银杏叶;黄酮;提取

银杏（Ginkgo biloba L.）系银杏科银杏属乔木，亦称白果树或公孙树，是古老的中生代孑遗植物，有“活化石”的美称[1-2]。我国银杏资源丰富，约占全世界的70%左右[3]，每年秋季有大量的银杏叶落叶被丢弃或焚烧，造成一定污染。银杏叶含黄酮、萜类物质、生物碱、糖类物质和蛋白质等，其中黄酮是银杏叶提取物的关键药效成分之一。黄酮广泛存在于自然界，具有多种活性，例如抗氧化、抑菌、抗肿瘤和护肝等，且无明显副作用，可应用于制药和食品加工等领域[4]。迄今，已有大量关于银杏叶黄酮提取的报道，本文对近年银杏叶黄酮的实验室提取技术进行了综述和展望，拟为银杏叶黄酮的进一步开发提供支持与参考。

1 传统提取方法

1.1 碱液提取

银杏叶黄酮大多具有酚羟基，呈弱酸性，难溶于酸性水，易溶于碱性水，因此可以利用碱性水溶液或碱性醇溶液提取，之后，对提取液进行酸化，使银杏叶黄酮形成沉淀析出。黄酮母核的多样性主要与黄酮骨架、环系的变化、氧化程度和数量有关，在加热条件下，高浓度碱液可破坏黄酮的母核结构;提取液被酸化时，为防止生成“佯盐”，pH值也不能太低。在已报道的碱液提取银杏叶黄酮工艺中，使用较多的碱液有氢氧化钠-水溶液、氢氧化钠-乙醇溶液及碳酸钠-水溶液等，pH值一般控制在9.0～10.0;酸化提取液时一般使用硫酸或盐酸调节pH值。碱液提取银杏叶黄酮可提高提取得率、缩短提取时间，且使蛋白质、粘液质和含COOH-果胶等形成沉淀而被除去，缺点是提取设备易被腐蚀。齐建等[5]比较了几种溶剂对银杏叶黄酮提取得率的影响，发现0.2% NaOH的提取效果优于蒸馏水。

1.2 熱水提取

天然黄酮除少数游离外，大多与糖结合形成苷，其中黄酮苷易溶于水、乙醇、甲醇等;游离的黄酮即黄酮苷元难溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮和正丁醇等有机溶剂，根据“相似相溶”原理，热水提取银杏叶黄酮得到的主要成分是黄酮苷[6]。闫高颖等[7]用热水提取银杏叶黄酮，通过优化得到最适工艺：100 ℃条件下提取3次，每次1 h，料液比为1∶26，在此条件下黄酮得率为0.59%。热水提取银杏叶黄酮的优点是提取溶剂无毒、无味、无污染且可再生，具有提取设备简单、成本低和提取液中的脂溶性杂质少等优点，但热水提取需要的温度较高，一般在90 ℃以上，易使银杏叶黄酮的生物活性受损;提取过程中溶出的蛋白质、无机盐及其他一些水溶性杂质，导致提取液易腐败变质，加大了后续分离纯化的难度。

1.3 有机溶剂提取

当原料加入到有机溶剂中时，有机溶剂会进入细胞壁，渗透到细胞内，溶解可溶性物质，使细胞内外产生浓度差，直到细胞内外的溶液浓度达到动态平衡。为减小溶剂挥发损失和提高提取效率，该技术一般采用回流加热装置，可供选的溶剂有甲醇、乙醇、正丁醇和丙酮等，其中甲醇和丙酮毒性较大，正丁醇沸点较高且有刺激性，都很少使用，大多使用廉价、易回收、毒性小的乙醇，并将乙醇与水混溶作为提取溶剂S[8]。乙醇浓度越高，提取溶剂极性越低，色素等脂溶性杂质越易溶出，乙醇浓度越小低，提取溶剂极性越大，水溶性杂质越易浸出，因此在银杏叶黄酮的有机溶剂提取工艺中，乙醇浓度一般控制在50%～85%，李英[9]在乙醇浸提银杏叶黄酮的工艺中，得到理想条件：4倍体积（v/w）的浓度为70%的乙醇溶液于60 ℃条件下进行6级（单级

20 min）逆流浸提。有机溶剂提取所需温度一般低于热水提取，且提取液过滤、溶剂回收和产物干燥等过程易于进行，但存在能耗高、污染大、效率低与耗时长等缺点。

2 新兴提取方法

2.1 酶辅助提取

酶辅助提取能提高银杏叶黄酮提取得率，且反应条件温和、污染小，具有黄酮活性受损小、结构受保护等优点[10]。该技术是利用酶降解细胞壁成分，从而改变细胞壁通透性，减小银杏叶黄酮从胞内溶出的阻力，以提高提取得率;亦可采用转苷酶和糖等底物将黄酮苷元转换成黄酮苷，以提高黄酮在提取溶剂中的溶解度，促进提取的进行。植物细胞壁由纤维素、果胶、半纤维素等组成，在破坏细胞壁结构方面，可选择的酶有纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶及复合酶等。冯自立等[11]采用复合酶（纤维素酶∶果胶酶=1∶1）提取银杏叶黄酮，发现复合酶用量为银杏叶的1/300、酶解

4.0 h、温度50 ℃、初始pH为5.0时，酶解效果最佳，该工艺条件下，总黄酮提取率为92.38%。纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶等是蛋白质，温度、pH值与提取溶剂种类等都会影响其酶活，条件过高或过低都会使酶活性受损，在银杏叶黄酮提取工艺中，提取温度一般为40～50 ℃，pH值一般为4.5～7.0。

2.2 超临界流体提取

近些年，超临界流体提取技术已被广泛应用于医药、食品和石油等领域[12]。在超临界流体提取银杏叶黄酮的工艺中，可供选的溶剂较多，如CO2、NO、NH3和C2H6等，其中CO2以不燃、无毒、价廉且无色，具有易精制、易达到超临界条件等优点而被普遍使用。CO2是非极性物质，纯SF-CO2适合提取极性较低的亲脂性物质或分子量较低的脂肪烃，但银杏叶黄酮以极性的黄酮苷居多，目前主要通过添加夹带剂提高银杏叶黄酮在SF-CO2中的溶解度以提高提取得率，乙醇是常用的夹带剂，Shi-Feng Miao[13]等采用超临界CO2提取银杏叶黄酮，得到最适条件：提取压力20 MPa、提取温度40 ℃、夹带剂乙醇流量

6 mL/min、CO2流量10 g/min、提取时间90 min，在此条件下黄酮得率为0.36%。超临界CO2提取银杏叶黄酮所需温度较低，SF-CO2具有抗氧化和灭菌作用，且溶剂残留少、污染小，因此有“绿色技术”的美名;但装备复杂，投资大、成本高，导致建立大规模生产线难度大[14-15]。

2.3 超声波辅助提取

超声波是一种频率高于人类听觉上限的声波，它方向性好、穿透力强，常用来提取、清洗、消毒杀菌和碎石等[16]。超声波辅助提取银杏叶黄酮是利用超声波的空化、机械、热和化学效应等加速细胞内有效成分的释放、扩散和溶解，促进提取的进行。罗教等[17]利用超声波辅助提取银杏叶黄酮，通过工艺优化，确定在液料比30∶1（mL/g）、乙醇浓度70%、提取温度75 ℃条件下超声20 min，提取得率可达2.781%。超声波辅助提取银杏叶黄酮操作简单，设备维护和保养方便，具有杂质溶出少和低温节能等优点，缺点是会产生噪音，且超声波能断开碳-碳键，产生活性较强的自由基，破坏黄酮的生物活性及稳定性[18]。可供选的超声波装置有超声波细胞粉碎机、超声波发生器和超声波清洗器等，大多超聲波清洗器不具有功率调节功能，但其成本低、容量大、投料方便，因此在银杏叶黄酮提取工艺中的应用较多。

2.4 微波辅助提取

自1987年Ganzler等[19]率先使用微波技术分别从蚕豆和棉花中提取嘧啶苷和棉籽酚以来，微波已被广泛应用于黄酮、生物碱、多糖等天然活性物质的辅助提取中。传统热提取是以热传导、热辐射等途径从外向里进行加热，这种方法效率低、时间长;微波辅助提取银杏叶黄酮主要是利用微波的热效应，微波可瞬间穿透物料，里外同时受热进行提取，因此该技术具有较高的黄酮得率且省时，一般仅需1～30 min，这是该技术最显著的特点，此外该技术的优点有：易控制、选择性好和节能等[20-21]。微波辅助提取银杏叶黄酮的缺点是若微波辐射不均匀，易造成局部温度过高，致使黄酮活性受损，且设备泄漏的微波辐射会对人体造成慢性损伤。在微波辅助提取银杏叶黄酮工艺中，影响提取效果的参数包括溶剂种类、料液比、溶剂浓度、微波时间、微波温度与微波功率等，因微波温度与微波功率这两者具有较高的相关性，在实验中一般只考虑其中一个因素，且大多只考虑微波功率，徐春明等[22]利用微波辅助提取银杏叶黄酮，结果表明：在最优条件料液比1∶15（g/mL）、乙醇浓度70%、微波功率300 W、微波时间1 min下黄酮得率为2.698%。

2.5 其他新兴提取技术

其他新兴提取技术有联合提取和微生物发酵提取等。联合提取是指将两种或两种以上的辅助技术同时先后应用于提取中，辅助技术有超声波-微波、超声波-酶、微波-酶和等，提取溶剂可以是水、碱液和乙醇等。微生物发酵提取银杏叶黄酮是利用微生物在发酵过程中产生的复合酶系分解细胞壁中的大分子，如纤维素、半纤维素和果胶等，促进目标组分从细胞内溶出;该技术的优点是成本较低，且实验条件温和，但周期较长，一般需要几天的时间，且培养基、菌体和代谢产物的存在给银杏叶黄酮粗提液的分离纯化带来困难。

3 展望

在银杏黄酮提取新工艺的开发中，可以从辅助技术和提取溶剂两方面下手;在考虑提高提取得率和保护黄酮生物活性的同时，应结合提取工艺的成本、安全性、稳定性、试剂回收方法以及提取渣的处理方式等。并积极开发提高原料利用率的措施，例如将提取渣作为提取其他有效成分的原料或经过处理使之变成饲料或肥料。

目前，银杏叶黄酮的提取工艺大多仅以黄酮得率为考察指标，但银杏叶除含有黄酮外，还有萜类、多糖和生物碱等，在资源日渐匮乏的情况下，有必要加强对银杏叶中活性物质的综合提取研究。银杏叶黄酮粗提液中有大量杂质，如脂肪、蛋白质和色素等，需纯化才能被更好地应用，如能将纯度纳入评价指标，可以减轻后续分离纯化工艺的负担。

树龄、性别、季节、光照、产地、海拔、温度和降雨量等因素会对银杏叶黄酮含量、成分和功效等产生影响，吴雅琼等[23]对不同产地银杏黄酮及相关活性物质含量情况进行了研究，发现来自汉中的银杏叶中黄酮含量最高。都匀产地黄酮含量的变异系数最大，在产地间选择的同时也需要关注产地内的选择。

银杏树生长缓慢，自然条件下从栽种到结果要20多年，大量结果则要更久，因此得名“公孙树”。植物组织培养省时、占地少，可获得无毒苗，不受季节限制，且具有繁殖方式多和经济效益高等优点，利用银杏组织培养技术为银杏叶黄酮的提取提供优质原料是一个值得探讨的课题。

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作者简介：谷政伟（1990—），男，湖南郴州人，硕士。研究方向：化学元素含量分析。