调味香料排草中黄酮的提取条件优化及抗氧化活性的研究

杜丽霞，陈明，朱文涛，姜子涛,2*

(1.天津天狮学院 食品工程学院，天津 301700；2.天津商业大学 生物技术与食品科学学院，天津 300134)

排草具有浓郁的香气，是近年来在麻辣火锅、干锅、卤菜中普遍使用的一种调味香料，具有增香、去腥和防腐的作用。排草又名排草香、香排草、香草等，正名为细梗香草(LysimachiacapillipesHemsl.)，报春花科珍珠菜属多年生草本植物[1,2]。在我国的贵州、四川、湖北、江西、广东等地以及印度、斯里兰卡、缅甸等地均有分布。排草的化学成分主要为皂苷[3-5]、挥发油[6]和黄酮。排草挥发油可用于调配化妆品及烟草用香精。排草中的皂甙(主要是三萜类皂甙)具有非常强的抗肿瘤活性。排草作为中草药已有两千多年的历史，具有很高的药用价值，可用于治疗水肿、浮肿、肿瘤等疾病。国内外对排草化学成分的研究主要集中在皂甙的分离鉴定以及皂甙的抗肿瘤活性[7-14]，而关于挥发油和黄酮类化合物的研究则极少报道。由从前面的研究可知，排草中的黄酮主要是山奈酚和槲皮素两大类[15,16]。已报道的排草黄酮提取方法是以水或乙醇作为提取剂的传统提取法[17]，前者由于提取剂极性较强，存在着黄酮提取不完全、杂质多的问题；同时这两种方法均存在提取时间长、提取效率低等缺陷。

本研究采用超声波辅助提取法提取排草黄酮，通过单因素试验和正交法确定了排草黄酮的最佳提取条件，并利用大孔吸附树脂对所获得的排草黄酮进行提纯；测定了排草黄酮清除二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基和抗氧化活性，并与食用抗氧化剂维生素C(Vc)进行了比较，为排草及黄酮的进一步开发和利用提供了可靠的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

排草样品：购于天津市武清药店，粉粹后过40目筛，置于广口瓶中避光保存。芦丁：上海源叶生物科技有限公司；DPPH：美国Sigma公司；Vc：北京谱析科技有限公司；乙醇：天津市风船化学试剂科技有限公司；DM130、D101、AB-8、HPD-600和HPD-100 5种大孔树脂：天津南大树脂科技有限公司提供，使用前按照文献[18]进行预处理；试验用水均为去离子水，所用试剂均为分析纯。

U3900型紫外可见分光光度计 日立高新技术公司；UV1000型紫外可见分光光度计 上海天美科学仪器有限公司；YM-650CT型多用途恒温超声提取仪 上海豫明仪器有限公司；LGJ-10NS型冷冻干燥机 北京亚星仪科科技发展有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 排草黄酮的提取

准确称取一定质量的排草粉末，置于具塞三角瓶中，按照一定的料液比加入一定浓度的乙醇溶液，加盖后置于超声波仪中，设定好提取温度和提取时间后进行提取，最后将提取液在4000 r/min转速下离心20 min，取上清液备用。

1.2.2 排草黄酮得率的测定

准确称取芦丁标准品15 mg，加甲醇溶解后转移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容并混匀，配制成150 μg/mL的芦丁标准溶液，然后按照参考文献[19]中的方法进行显色和测定，绘制芦丁标准曲线。

准确吸取制得的排草黄酮溶液1 mL置于25 mL容量瓶中，从加水至6 mL开始，按照参考文献[19,20]的方法进行显色测定，将测得的吸光度值带入上述的芦丁标准曲线中，然后按照此式计算黄酮得率：黄酮得率(%)=C·V/10M。式中：C为由线性回归方程计算出的黄酮提取液浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；M为样品质量，g。

1.2.3 排草黄酮提取条件的优化

单因素试验：选取乙醇浓度、提取温度、料液比和提取时间4个因素，每个因素选取5个水平，进行单因素试验，确定每个因素中提取排草黄酮的最优水平。正交试验：根据单因素试验中确定的最优水平，设计四因素三水平的正交试验L9(34)，通过正交试验得到排草黄酮的最佳提取工艺条件[21]。

1.2.4 排草黄酮纯化条件的优化

将经活化后的DM130、D101、AB-8、HPD-600和HPD-100 5种大孔树脂分别装入玻璃层析柱中，然后通过吸附和解吸试验筛选出纯化效果最好的一种，最后对上样液pH、上样流速、洗脱液乙醇浓度及洗脱流速4个单因素进行优化[22]，得到排草黄酮的最佳纯化条件。

1.2.5 排草黄酮抗氧化活性

将经过纯化后的排草黄酮冻干粉配制成10～100 μg/mL的溶液，从不同浓度的排草黄酮溶液中各取0.6 mL分别放于10支编号的比色管中，各加入6 mL 0.06 mmol/L DPPH溶液，混匀后避光静置30 min，在507 nm下测定吸光度值，记作Ar(1～10)；取0.6 mL 80%乙醇溶液，再加6 mL 0.06 mmol/L DPPH溶液，混匀后避光静置30 min，测定吸光度值，记作Ac；从不同浓度的排草黄酮溶液中各取0.6 mL分别放于10支编号的比色管中，各加入6 mL 80%乙醇溶液，混匀后避光静置30 min，测定吸光度值，记作Ax(1～10)。按下列公式计算各浓度排草黄酮溶液的清除率。以横坐标为样品浓度、纵坐标为清除率，绘制纯化后的排草黄酮清除率曲线，并按照此式计算清除率IC50值：清除率(%)=(Ac-Ar+Ax)/Ac×100。

同上，绘制Vc对DPPH自由基的清除率曲线，计算IC50值，将两者的半数清除率进行比较，评价纯化后排草黄酮的清除自由基能力及抗氧化活性。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

按照1.2.2的方法测得的芦丁标准曲线，其线性回归方程为y=0.329x+0.0088(R2=0.9995)，线性关系良好，排草提取液黄酮浓度均用此方程进行计算。

2.2 提取排草黄酮的单因素试验结果

排草黄酮的单因素试验结果见图1。

图1 单因素对排草黄酮得率的影响Fig.1 Effect of single factors on the yield of flavonoids from L. capillipes

由图1中(a)可知，当乙醇浓度为60%时，排草黄酮的得率最高；当乙醇浓度低于60%时，部分醇溶性的黄酮未被充分提取出来；当乙醇浓度高于60%时，部分水溶性的黄酮未被充分提取出来，因此选择60%为最佳乙醇浓度。由图1中(b)可知，随着料液比增大，排草黄酮得率增高，当料液比在1∶20～1∶50之间时，黄酮得率增高速度大幅减缓，在保障黄酮得率的同时，为了减少提取剂的用量，降低成本，保护环境，最终选择1∶30为最佳的料液比。由图1中(c)可知，随着提取时间增长，排草黄酮得率增高，当提取时间为80～100 min时，黄酮得率增高不明显。为提高提取效率，选择80 min为最佳的提取时间。与文献[17]比较可知，超声波辅助提取能够明显提高黄酮的提取效率，提取时间较传统的溶剂提取法缩短了一半以上。这是因为超声波能促使植物的细胞组织破壁或变形，使黄酮成分提取更充分。由图1中(d)可知，提取温度为50 ℃时，排草黄酮的得率最高；当提取温度较低时，分子运动较慢，不利于黄酮的溶出；当提取温度过高时，黄酮类化合物会受热分解而损失掉，因此选择50 ℃为最佳提取温度。

2.3 提取排草黄酮的正交试验结果

正交试验结果见表1。

表1 正交试验结果Table 1 Orthogonal test results

由表1可知，影响排草黄酮得率的因素主次为：料液比>乙醇浓度>提取温度>提取时间。正交试验所得排草黄酮的最佳提取条件为：乙醇浓度50%，料液比1∶40(g/mL)，提取时间80 min，提取温度50 ℃。在此条件下平行提取3次，得到的排草黄酮得率分别为3.14%、3.18%、3.15%，平均值为3.16%。

2.4 大孔树脂的筛选

2.4.1 大孔树脂的静态吸附与解吸

5种不同类型的大孔树脂对排草黄酮的吸附和脱附结果见表2。

表2 5种大孔树脂对排草黄酮的静态吸附率与解吸率Table 2 Static adsorption rate and desorption rate of fivemacroporous resins on flavonoids from L. capillipes %

由表2可知，型号为HPD-100的大孔树脂对排草黄酮的吸附和脱附效果均最好，因此选择型号为HPD-100的大孔树脂对排草黄酮进行纯化。

2.4.2 吸附及解吸动力学曲线

由图2吸附动力学曲线中可知，0～70 min时 HPD-100大孔树脂对排草黄酮的吸附速度比较快，而在70～250 min吸附速度逐渐放缓并趋于平稳，此时大孔树脂吸附量达到饱和，计算出HPD-100大孔树脂对排草黄酮的最大吸附量为14.58 mg/g湿树脂。由图2解吸动力学曲线中可知，0～60 min时乙醇溶液对排草黄酮解吸速度较快，但60 min之后趋于平稳。

图2 HPD-100树脂对排草黄酮的吸附及解吸动力学曲线Fig.2 Adsorption and desorption kinetic curves of HPD-100resin on flavonoids from L. capillipes

2.5 排草黄酮纯化条件的优化

2.5.1 上样液pH值及洗脱液乙醇溶液浓度的确定

由图3中(a)可知，HPD-100大孔树脂的吸附效果受上样液pH值的影响较大，上样液pH为8时吸附效果最差，这是因为排草黄酮具有多酚结构，在碱性环境中，黄酮分子羟基中的H+离去，黄酮化合物形成离子结构，极性增强，故不易被吸附。因黄酮显弱酸性，故在酸性和弱酸性条件下易被吸附，但试验发现pH继续降低时黄酮粗品溶解度降低，可能是因为pH继续降低，达到排草黄酮的等电点，上样液不稳定，所以上样液pH为4时吸附效果最好。由图3中(b)可知，洗脱液乙醇浓度为80%时，解吸下来的排草黄酮量最多，因此使用80%的乙醇溶液作为最佳的洗脱液。

图3 上样液pH值及洗脱液乙醇溶液浓度对纯化效果的影响Fig.3 Effect of pH of loading buffer and ethanol solution of eluent on purification effect

2.5.2 上样流速及洗脱流速的确定

由图4中(a)可知，当上样流速为2 BV/h时，泄漏点出现的较早，此时排草黄酮由于流速过快而未被充分吸附到柱子上；当上样流速为1.5 BV/h和1 BV/h时泄漏点出现的时间差不多，上样体积均大于2 BV/h时，且1.5 BV/h的上样量比1 BV/h时略大。因此，最终选择最佳上样流速为1.5 BV/h。由图4中(b)可知，当洗脱流速为1.5 BV/h时，排草黄酮的洗脱效果最佳。当洗脱流速增加时，乙醇会以略快的流速流经大孔吸附树脂，不能充分渗入树脂内部，无法将树脂内的排草黄酮全部解吸出来，从而致使洗脱效果下降。而当洗脱流速过慢时，乙醇会在大孔树脂中停留过久，使黄酮的峰宽较大，时间更长，洗脱效果不好，因此选择最佳洗脱流速为1.5 BV/h。

图4 上样流速及洗脱流速对纯化效果的影响Fig.4 Effect of flow rate of loading buffer and eluent on purification effect

2.6 排草黄酮抗氧化活性的研究

按照1.2.5中的方法测定排草黄酮及Vc清除DPPH自由基的曲线，得到排草黄酮清除率回归方程为Y=-0.01X2+1.9609X-7.9433(R2=0.9965)。经计算排草黄酮对DPPH自由基的半数清除率IC50为36.25 μg/mL。Vc清除率回归方程为Y=-0.0119X2+2.1058X+0.2917(R2=0.9665)，经计算，Vc对DPPH自由基的半数清除率IC50为28.05 μg/mL。综上所述，排草黄酮的抗氧化活性与Vc比较稍差，但仍然具有较强的抗氧化活性。

3 结论

超声波辅助法提取排草黄酮的最佳条件为：提取时间80 min，提取温度50 ℃，乙醇浓度50%，料液比1∶40，在最佳提取工艺条件下排草黄酮的得率为3.16%；最佳纯化条件为：选取HPD-100型号的大孔树脂，上样液pH为4，上样流速为1.5 BV/h，洗脱剂乙醇浓度为80%，洗脱流速为1.5 BV/h，经纯化后排草黄酮的纯度由原来的24.8%提高到68.1%，纯化效果较好；排草黄酮对DPPH自由基的半数清除率IC50值为36.25 μg/mL，与Vc比较稍差，但仍然表现出较强的抗氧化活性，是一种可开发的高效、天然的抗氧化剂。