化浊清脂方对2型糖尿病合并高脂血症大鼠内脂素水平、氧化应激及肝细胞凋亡的影响Δ

房 丹，田利平，周志焕

(1.联勤保障部队第九八三医院和平院区内四科，天津 300020； 2.天津中医药大学方剂教研室，天津 300193)

糖尿病是一种致病机制较为复杂的综合性疾病，患者不仅会出现糖代谢异常，通常还伴随脂代谢紊乱。有研究结果指出，多数2型糖尿病患者都存在血脂异常的情况，单纯控制患者的血糖情况可以有效降低糖尿病微血管并发症，但不能有效避免冠心病及其并发症的发生[1]。目前，国际上的主流调节血脂药包括他汀类、烟酸类及贝特类等[2]，但长期西药治疗容易对机体的各器官及其功能造成不良影响，药物联合应用的过程中也可能出现一定的拮抗作用，导致西药治疗存在一定的局限性。相比之下，中药治疗强调整体调节，其药方众多、效力持久、标本兼治且副作用较小，在治疗2型糖尿病合并高脂血症方面具有很大的潜力[3]。本研究探讨了化浊清脂方治疗2型糖尿病合并高脂血症大鼠的临床疗效，旨在为临床上2型糖尿病合并高脂血症的防治工作提供一定的理论依据，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：健康雄性SD大鼠60只，体重(250±20)g。购自凯学生物科技(上海)有限公司，许可证号为No.0251284。大鼠于动物房内饲养，温度调整为18～22 ℃，相对湿度40%～65%，用普通饲料饲养，自由饮水。

1.1.2 药物：化浊清脂方组方为制首乌、生黄芪和桑葚各15 g，西洋参、生地各12 g，红曲、南山楂、麦冬、党参、白芍和丹参各10 g，五味子5 g，甘草3 g；药材均取自联勤保障部队第九八三医院和平院区中药房，加入8倍量水煎煮2次后过滤去除药渣，制成相当于原生药2 g/ml的水煎液。二甲双胍(贵州天安药业股份有限公司，批准文号为国药准字H52020960)，脂必妥胶囊(成都地奥九泓制药厂，批准文号为国药准字Z20100035)。

1.1.3 仪器与试剂：(1)主要仪器。CytoFLEX型流式细胞仪(Beckman Coulter 美国)。(2)主要试剂。羊抗鼠FITC-IgG荧光抗体(货号：KS007)、小鼠Bax单克隆抗体(货号：hzm-33 283 M)、小鼠Bcl-2单克隆抗体(货号：hzm-33 411 M)及丙二醛(MDA)试剂盒(货号：HZ-MDA-Ge)均购自上海沪震实业有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(货号：CSB-E08 556 m-1)、晚期糖基化终末产物(AGEs)试剂盒(货号：CSB-E09 413 r-1)、晚期蛋白质氧化产物(AOPP)试剂盒(货号：CSB-EQ027429RA-1)及内脂素试剂盒(货号：CSB-E08 941 r-1)均购自上海恒斐生物科技有限公司；链脲佐菌素(货号：82342)购自北京凯瑞基生物科技有限公司。

1.1.4 饲料配方：普通饲料购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司；高糖高脂饲料配方为83.25%普通饲料、0.25%胆酸钠、1.5%胆固醇、5%蔗糖及10%猪油。

1.2 方法

1.2.1 2型糖尿病合并高脂血症大鼠模型制备：选择60只健康SD雄性大鼠，用常规饲料喂养1周之后，采用体重随机区组法将大鼠分为正常组(n=6)与模型组(n=54)。正常组大鼠继续用常规饲料喂养，模型组采用高糖高脂饲料喂养，连续8周。之后对所有大鼠禁食12 h，期间大鼠可自由饮水。用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0.1 mol/L)将链脲佐菌素在冰浴条件下，配制成pH=4.2的溶液，模型组大鼠腹腔注射2%链脲佐菌素溶液30 mg/kg，正常组大鼠注射同剂量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。72 h后检测各组大鼠血脂、空腹血糖(FBG)水平，FBG>11 mmol/L，血清高密度脂蛋白胆固醇水平降低，低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯及总胆固醇水平升高则视为建模成功，选取36只与正常组存在明显差异的大鼠作为研究对象。

1.2.2 方法：将模型组36只大鼠通过体重随机区组法分为模型组、二甲双胍组、脂必妥胶囊组与化浊清脂方组(低、中及高剂量)6组，每组6只。(1)正常组大鼠与模型组大鼠用同体积蒸馏水灌胃；(2)二甲双胍组采用二甲双胍溶液灌胃，用药剂量为250 mg/kg；(3)脂必妥胶囊组用脂必妥胶囊溶液灌胃，用药剂量为128 mg/kg；(4)化浊清脂方组用化浊清脂方组灌胃，低剂量组剂量为2.09 g/kg，中剂量组剂量为4.17 g/kg，高剂量组剂量为8.35 g/kg。连续治疗1个月，治疗期间各组大鼠均用常规饲料饲养，自由饮水。

1.2.3 内脂素、氧化应激指标检测：所有大鼠接受1个月的药物治疗，禁食12 h，期间自由饮水，末次给药1 h后，腹腔注射水合氯醛对大鼠进行麻醉(0.3 ml/100 g，10%)。在大鼠右侧颈总动脉采血5.0 ml，将采集的血液样本注入抗凝管内，室温(25 ℃)下静置15 min，之后将血液标本离心(3 000 r/min，15 min)，取血清液，在-70 ℃冰箱内保存。内脂素采用酶联免疫吸附法测定，SOD采用黄嘌呤氧化酶法测定，AGEs与AOPP采用高效液相色谱法检测，MDA采用硫代巴比妥酸法测定，均严格按照试剂盒说明执行各项操作。

1.2.4 肝细胞凋亡检测：剖取大鼠肝脏，取约500 mg的大鼠肝组织，用0.9%氯化钠溶液洗净并用滤纸吸干，将大鼠肝组织样本浸泡在70%乙醇溶液中进行固定，之后保存在4 ℃冰箱中待检。取出固定好的肝组织，将其置于120目不锈钢网上，下面放置一个平皿。用剪刀将其剪成1 mm3的碎块并轻搓组织，同时用PBS进行冲洗。将平皿中收集到的悬液过300目筛除去团块，收集细胞悬液并离心(1 000 r/min，3 min)，保留沉淀，加入0.3 ml PBS混匀。将细胞悬液分为3份，分别用于后续各项检查。采用PI一步插入性DNA定量荧光染色法对大鼠肝细胞进行染色，染液由1.0% Triton-X、100 μg/ml RNA酶、50 μg/ml PI混合而成。取1份细胞悬液加入1 ml染液，在4 ℃冰箱内染色30 min，用500目网筛过滤后上机检测。

1.2.5 B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达检测方法：取2份细胞悬液，分别加入100 μl小鼠Bax单克隆抗体一抗工作液与小鼠Bcl-2单克隆抗体一抗工作液(1∶100稀释)，在避光条件下孵育30 min，用PBS冲洗2次。加入100 μl羊抗鼠FITC-IgG荧光二抗在避光条件下孵育30 min，用PBS冲洗2次。弃上清液，在收集到的细胞沉淀中加入1 ml PBS，用500目网筛过滤后上机检测。采用CytoFLEX型流式细胞仪进行检测，实验前，用鸡红细胞标准样品对仪器进行校正。采用Muticycle AV软件分析DNA细胞周期，采用Expo32ADC软件对免疫荧光数据进行分析，AI表示细胞凋亡程度，PI表示增殖指数，FI表示免疫荧光指数。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 化浊清脂方对2型糖尿病合并高脂血症大鼠内脂素水平、氧化应激指标的影响

模型组大鼠内脂素水平高于其他组，且与正常组和化浊清脂方低、中及高剂量组相比的差异均有统计学意义(P<0.05)；模型组大鼠SOD水平低于其他组，AGEs、MDA及AOPP水平高于其他组，上述氧化应激指标与正常组和化浊清脂方中、高剂量组相比的差异均有统计学意义(P<0.05)，AOPP水平与化浊清脂方低剂量组的差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 化浊清脂方对2型糖尿病合并高脂血症大鼠内脂素、氧化应激指标水平的影响Tab 1 Effect of prescription of turbidity-resolving and lipid-eliminating on visfatin level, oxidative stress and hepatocyte apoptosis in rats with type 2 diabetes complicated with hyperlipidemia

2.2 化浊清脂方对2型糖尿病合并高脂血症大鼠肝细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测结果显示：模型组大鼠的AI高于其他组，与正常组、二甲双胍组及化浊清脂方低、中剂量组相比的差异均有统计学意义(P<0.05)。模型组大鼠静止期(G0/G1期)细胞占比明显高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；略高于各给药组，但差异均无统计学意义(P>0.05)。模型组大鼠的PI明显低于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；略低于各给药组，但差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 化浊清脂方对2型糖尿病合并高脂血症大鼠肝细胞凋亡的影响Tab 2 Effect of prescription of turbidity-resolving and lipid-eliminating on hepatocyte apoptosis in rats with type 2 diabetes complicated with hyperlipidemia %)

2.3 化浊清脂方对2型糖尿病合并高脂血症大鼠Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

流式细胞仪检测结果显示：模型组大鼠的Bax蛋白表达FI值明显高于正常组、化浊清脂方低、中及高剂量组；Bcl-2蛋白表达FI值明显低于正常组、二甲双胍组及化浊清脂方低、中剂量组；Bax/Bcl-2蛋白表达水平明显高于正常组、二甲双胍组和化浊清脂方低、中及高剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 化浊清脂方对2型糖尿病合并高脂血症大鼠Bax、Bcl-2蛋白表达的影响Tab 3 Effect of prescription of turbidity-resolving and lipid-eliminating on Bax and Bcl-2 protein expression in rats with type 2 diabetes complicated with

3 讨论

3.1 化浊清脂方治疗2型糖尿病合并高脂血症

糖尿病合并高脂血症在中医学中属于“瘀血”“痰浊”和“消渴”等范畴，认为其病机在于脂质摄入过量、饮食肥甘味厚，导致痰浊内生、脾胃运化失常[4];且内在气阴两虚、脏腑失调，需治以化瘀降浊、益气补阴之方[5]。本研究选用化浊清脂方，其中制首乌补血消脂，补肝益精；生黄芪补气升阳，利尿消肿；桑葚补血滋阴，生津润燥；西洋参补气养阴，清热生津；生地补血滋阴，益精填髓；红曲健脾消食，活血化瘀；南山楂消积化滞，破气散瘀；麦冬养阴生津，润肺止咳；党参补中益气，健脾益肺；白芍平肝止痛，养血调经；丹参祛瘀止痛，活血通经；五味子敛肺止咳，滋补涩精；甘草调和诸药，共奏化浊清脂之效。

3.2 内脂素、氧化应激与2型糖尿病合并高脂血症的关系

近年来，有学者发现内脂素与糖尿病的发生有着密切关联[6]。内脂素的主要生理功能在于与胰岛素受体上的非胰岛素位点结合，从而激活胰岛素信号传递途径，降低机体的血糖水平[7]。此外，内脂素还能够模拟胰岛素作用，刺激糖转运过程并抑制肝糖原分解，起到降低血糖的效果[8]。王蕊等[9]的研究结果指出，内脂素水平上调会参与2型糖尿病的发病过程，这与机体的氧化应激反应加强有关。糖尿病患者体内通常存在氧化应激反应，高糖状态会导致氧自由基含量升高，其可以作为第二信使介导胰岛素信号传播途径，使胰岛素受体及其底物蛋白磷酸化，导致机体出现胰岛素抵抗(IR)。IR会使内脂素的表达水平上调，促进其合成与释放。内脂素水平上升会激活蛋白激酶C信号传导通路，增强还原型辅酶Ⅰ、还原型辅酶Ⅱ的活性，导致活性氧水平进一步增加，从而加重机体的氧化应激反应[10]。故内脂素水平上调与氧化应激对糖尿病的疾病进展起到一定的协同作用。本研究结果表明，2型糖尿病合并高脂血症大鼠会出现内脂素异常升高与氧化应激反应加重的表现，具体表现为SOD水平降低，AGEs、MDA及AOPP水平异常升高。观察研究结果可知，给予大鼠药物治疗能够有效改善大鼠内脂素与氧化应激反应，且化浊清脂方组的治疗效果优于二甲双胍组与脂必妥胶囊组。说明化浊清脂方能够有效地调控2型糖尿病合并高脂血症大鼠的内脂素和氧化应激水平，控制大鼠的疾病进展情况。张唸等[11]、曲梅[12]主要通过检测大鼠血糖水平与脂代谢水平发现，中药治疗能够有效改善2型糖尿病合并高脂血症患者的疾病症状。根据对本研究结果的分析，认为中药治疗涉及到对内脂素和氧化应激的调节过程，多途径起到控制疾病进程的效果。

3.3 肝细胞凋亡与2型糖尿病合并高脂血症的关系

细胞凋亡可以帮助机体清除受损、衰老和有害的细胞，维持细胞正常微环境，具有重大的生物学意义[13]。在2型糖尿病合并高脂血症患者中普遍存在IR现象，导致患者肝组织中游离脂肪酸(FFA)水平上调，FFA表现出较强的细胞毒性，其在肝细胞中大量堆积会导致线粒体膜屏障受损，导致凋亡因子进入细胞浆，诱发细胞凋亡[14]。通常情况下，细胞凋亡是在凋亡基因的调控之下进行的，2型糖尿病合并高脂血症患者肝细胞异常凋亡可能预示着患者凋亡基因存在异常[15]。高糖状态会导致脂蛋白糖基化，此外脂酰-COA水平升高也会导致中药蛋白质酰基化，促进肝细胞发生凋亡[16]。低、中剂量化浊清脂方组AI值与模型组相比的差异有统计学意义(P<0.05)，PI值的差异无统计学意义(P>0.05)，说明化浊清脂方可以介导2型糖尿病合并高脂血症大鼠的肝细胞凋亡过程。王晓丽等[17]的研究结果指出，红芪多糖主要通过调控凋亡基因的表达过程，减少大鼠肝细胞凋亡的发生概率。蔡嘉洛等[18]的研究结果指出，护心通络方可以调整Bax和Bcl-2的蛋白表达强度，借此调控内皮细胞的凋亡过程。本研究未对大鼠肝细胞凋亡的发生机制做出研究，关于化浊清脂方影响大鼠肝细胞凋亡的具体机制还需后续学者不断进行深入研究。宋晓静等[19]的研究结果显示，苦参碱可以通过调节Bax、Bcl-2的表达水平，从而抑制大鼠肝细胞过度凋亡，促进大鼠肝细胞正常功能的恢复。杨娜等[20]的研究结果认为，谷树叶不同提取物可以通过对大鼠Bax、Bcl-2的调节作用，对抗大鼠血管内皮细胞凋亡。本研究结果表明，化浊清脂方可以降低Bax的表达水平，并上调Bcl-2的表达水平，降低AI值。但其是否能够促进大鼠肝组织修复与再生，还需在后续研究中继续验证。

综上所述，化浊清脂方可以有效降低2型糖尿病合并高脂血症大鼠内脂素水平，改善大鼠氧化应激状态；并通过增强Bcl-2蛋白表达、减弱Bax蛋白表达来降低大鼠肝细胞凋亡率。