牛肉肌纤维类型差异及成熟过程中组织蛋白酶活性研究

丰永红 李海鹏 张松山 谢 鹏 徐晨晨 孙宝忠

(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所， 北京 100193)

0 引言

肌纤维是组成肌肉的基本单位，其类型、直径、密度及完整性与肉的嫩度密切相关，肌束中肌纤维数越多，肌纤维越细，肉就越嫩[1]。通常按照形态或生理功能将肌纤维分为不同的类型。早期，肉类科学家依据肌肉颜色将骨骼肌分为红肌和白肌两种类型[2]，肌肉色泽与肉品质及动物生长性能有关，高比例的红肌纤维在一定程度上代表较好的肉品质，而高比例的白肌纤维则更多地代表较强的生长性能[3]。随着对肌纤维研究的深入，依据其收缩和代谢特点进一步将肌纤维分为慢收缩氧化型(Slow oxidative，SO)、快收缩氧化型(Fast oxidative，FO)、快收缩氧化酵解型(Fast oxido-glycolytic，FOG)及快收缩酵解型(Fastglycolytic，FG)[4]。目前较为广泛应用的ATP酶染色法将肌纤维分为Ⅰ、ⅡA、ⅡB，也是基于肌纤维收缩特点的分型。利用现代分子生物学方法，根据肌纤维所含肌球蛋白重链(Myosin heavy chain，MyHC) 的不同亚型，将肌纤维分为Ⅰ、Ⅱa、Ⅱx 和Ⅱb ，代谢类型从氧化到酵解过渡，收缩速度依次增加[5]。因此，可以将MyHC基因作为分子标记，利用RT-PCR分析方法研究肌纤维类型及组成，相比于其他组化染色法该方法既省时又省力[6]。

依据不同肌纤维类型的代谢特性以及MyHC基因亚型的不同，肌纤维的分型方法主要有：组织化学法(ATPase法)、免疫印迹法、免疫组化法、RT-PCR法、单向凝胶电泳后LC-MS/MS(液相色谱-串联质谱)法[7-8]。尽管LC-MS/MS法所得总肽数与免疫组化法所得结果呈极高度正相关，但由于受个别蛋白质和肽的限制，该法仍不能用于MyHC的定量研究[7-8]。尽管肌纤维因分类方法多样而命名各异，但不同分类方法确定的肌纤维之间存在一定的相关性，如SO型肌纤维即为Ⅰ型，FO型肌纤维为Ⅱa型，FG型肌纤维为Ⅱb型，FOG型肌纤维为Ⅱx型[9]。然而，不同分类方法所确定的肌纤维类型之间是否存在完全对应关系尚有待进一步研究[10]。

近年来研究表明，肌肉中不同肌纤维类型的比例可影响宰后肉的嫩度[11]，较高的Ⅰ型肌纤维和较低的ⅡB型肌纤维比例有利于降低肉的剪切力、提高肉的嫩度[12]。一般认为，宰后成熟过程是肌肉内源蛋白质水解酶的作用所致，肉的嫩化是一个复杂的物理化学(包括pH值和离子强度)和生物化学(细胞内蛋白水解酶)过程，在这个过程中，肌原纤维结构被破坏，细胞骨架逐渐消失[13]。组织蛋白酶存在于溶酶体中，溶酶体膜在成熟过程中会遭到破坏，使组织蛋白酶从中释放出来，与肌原纤维蛋白接触[14-16]。因此，很多学者认为，在宰后成熟过程中，钙激活酶对肌肉骨架蛋白进行初步降解，组织蛋白酶在成熟后期对骨架蛋白进行进一步降解[17-19]。更深入的研究表明，在宰后成熟过程中溶酶体膜稳定性降低，组织蛋白酶从中释放出来后被活化，进而诱导凋亡反应的发生[20]。位于细胞溶酶体中的组织蛋白酶大约有16种，依据活性位置可分为4类：天冬氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、金属蛋白酶，与肌肉成熟有关的主要是组织蛋白酶B (EC 3.4.22.1)、L (EC 3.4.22.15)、H (EC 3.4.22.16)和D (EC 3.4.23.5)。B、H、L属半胱氨酸类组织蛋白酶，在活体内由半胱氨酸蛋白酶抑制剂调节[21]。关于组织蛋白酶的提取和活性检测已有大量研究，但肌纤维类型组成与组织蛋白酶之间的关系尚未见报道，本文通过考察不同肌纤维类型组成的各部位牛肉在宰后成熟过程中组织蛋白酶B、H、L活性的变化，研究肌纤维类型与组织蛋白酶之间的关系，进而探讨不同类型的肌纤维通过其组织蛋白酶活性差异影响牛肉宰后成熟过程中嫩度变化的可能性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

牛肉样品取自新疆伊宁县伊新牛羊养殖专业合作社。选取6头30月龄新疆褐牛公牛，按照GB/T 19477—2004《牛屠宰操作规程》[22]屠宰后热剔骨分割取左半胴体的冈下肌、菱形肌、腰大肌、背最长肌、背阔肌、腓肠肌、半腱肌和股二头肌共8个部位肉，按以下操作取样：切2 cm×1.5 cm×1.5 cm大小的肉样各3条迅速置于液氮中冷冻以固定形状，然后用铝箔包装投入液氮中冷冻，再转入-80℃冰箱(用于ATPase染色)；取约100 mg肉样3块，置于液氮冷冻后转入-80℃冰箱(用于RT-PCR分型)；取约10 g肉样铝箔包好后液氮冷冻，转入-80℃冰箱保存，用于组织蛋白酶活性检测。另取约100 g肉样真空包装后置于4℃冰箱中成熟，分别在宰后的3、7、9、11、14 d取样，取样时切取10 g左右样品铝箔包好后先用液氮迅速冷冻，然后转移到-80℃超低温冰箱内，用于检测组织蛋白酶活性。所有样品按照保存要求置于干冰或冰块中运回实验室。

主要试剂：7-氨基-4-甲基香豆素 (AMC)、Z-精氨酸-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素盐酸盐、Z-苯丙氨酰-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素盐酸盐、L-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素盐酸盐，均购自Sigma公司。RNAPrep Pure动物组织总RNA提取试剂盒D431、FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(去基因组)KR106、SuperReal 荧光定量预混试剂增强版FP205，均购自天根生化科技(北京)有限公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 试验设备

FJ200-S型高速均质机(北京维欣仪奥科技有限公司)；LG10-24A型高速离心机(北京京立离心机有限公司)；XS105型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；leica CM1860型冰冻切片机(德国莱卡公司)；leica DM6000 B型正置荧光显微镜(德国莱卡公司)；HH-4 型可调恒温数显水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)；Tecan Infinite 200 Pro型多功能酶标仪(Tecan 集团有限公司)；LineGene 9600型荧光定量PCR仪(杭州博日科技有限公司)；OSE-Y30型高速组织研磨器、OSE-DB-01加热型金属浴、OSE-MC8微型离心机(天根生化科技(北京)有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1肌纤维类型、直径、面积测定

肌纤维类型分型采用ATP酶组织化学染色法中的碱性染色法[23-24]：采用莱卡冰冻切片机连续切片，制备8 μm厚的新鲜切片，室温(20℃)晾干后，加入碱性ATP孵育液(ATP酶工作液(0.01 mol/L甘氨酸-氯化钠溶液50 mL，1 mol/L氯化钙溶液10 mL，0.1 mol/L氢氧化钠溶液35 mL，pH值为9.5～9.6)10 mL加入三磷酸腺苷二钠0.3 g溶解，pH值9.45)，37℃培育2 h。除去ATP酶工作液，置于1%氯化钙溶液6 min；除去氯化钙溶液，置于2%氯化钴溶液，蒸馏水洗3次，每次5 min；硫化铵溶液(10 mL蒸馏水加入8滴硫化铵)显色约1 min；自来水洗3次，乙醇脱水二甲苯透明后用树胶封片，生物显微镜100、400倍下镜检并拍照。本试验中，ⅡB型纤维被染成深褐色，ⅡA型纤维被染成浅褐色，Ⅰ型纤维颜色最浅。

1.3.2MyHC基因相对表达量测定

引物设计：在NCBI(美国国立生物技术信息中心)官网上查询基因序列，并采用Primer 5.0引物设计软件设计引物，具体见表1。

表1 RT-PCR分析用MyHC引物序列Tab.1 Primers used for real-time PCR analysis of MyHC gene expression

提取样本总RNA：使用天根生化科技(北京)有限公司的动物组织总RNA提取试剂盒(DP431)提取样本的RNA，试验操作按照产品说明书进行，略有改动。提取的RNA浓度用酶标仪检测，后冻存于-80℃。

逆转录合成cDNA：使用天根生化科技(北京)有限公司的FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(KR106)进行cDNA逆转录，试验操作按照产品说明书进行，略有改动。逆转录cDNA保存于-20℃备用。

RT-PCR：使用天根生化科技(北京)有限公司的SuperReal 荧光定量预混试剂增强版FP205进行扩增，试验操作按照产品说明书进行，略有改动。扩增程序：95℃、15 min，(95℃、10 s，60℃、32 s)×40个循环。逆转录体系：10 μL 2×SuperReal荧光定量预混试剂增强版；0.5 μL上游引物(10 μmol/L)；0.5 μL下游引物(10 μmol/L)；2 μL cDNA模板；加入去RNA酶的双蒸水至20 μL。

引物筛选：将各样本cDNA混合后进行5倍梯度稀释。稀释后样品各取2 μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60～95℃进行熔解曲线分析。

样品RT-PCR检测：将各样品cDNA 稀释10倍后取2 μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，每个样品重复检测3次。同时在60～95℃进行熔解曲线分析。

根据RT-PCR原始检测结果，基因相对表达量计算公式为

F=2-[A-B-(C-D)]

式中A——待测组目的基因平均Ct值

B——待测组管家基因平均Ct值

C——对照组目的基因平均Ct值

D——对照组管家基因平均Ct值

1.3.3组织蛋白酶活性测定

组织蛋白酶活性测定参照文献[25]的方法并加以改动。首先提取肌浆蛋白，提取方法：称取2 g绞碎的肉样，加入10 mL缓冲液A(50 mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl，pH值7.5)、10 mmol/L的β-巯基乙醇、1 mmol/L EDTA)，用高速分散机均质两次，每次30 s。置于冷冻离心机在4℃、10 000g下离心20 min，收集上清液，用玻璃棉过滤，滤液作为组织蛋白酶的粗提取物。

组织蛋白酶 L、B、H 活力的测定：反应在218 μL的混合液中进行，反应混合液包括98 μL 0.1% Brij35(月桂醇聚氧乙烯醚)、40 μL 0.4 mol/L含5 mmol/L EDTA的缓冲液(L+B、B及H缓冲体系的pH值分别为5.5、6.0、6.8)、20 μL 10 mmol/L L-Cys(L-半胱氨酸)和20 μL酶的粗提取液。将反应混合液置于40℃水浴中2 min后分别加入底物(Z-苯丙氨酰-精氨酸-7-氨基- 4-甲基香豆素盐酸盐(B+L)、Z-精氨酸-精氨酸-7-氨基- 4-甲基香豆素盐酸盐(B)和L-精氨酸-7-氨基- 4-甲基香豆素盐酸盐(H))40 μL，继续在40℃水浴中反应30 min后加入300 μL终止液(0.1 mol/L乙酸钠和0.1 mol/L氯乙酸钠，pH值4.3)终止反应。在激发波长为380 nm，发射波长460 nm条件下测定荧光强度。酶活力单位(U)定义为每分钟内催化1 μmol AMC 转化为产物所需的酶量。

1.4 数据处理与统计分析

以Image J图像分析软件分析Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型肌纤维数量百分比。计数时每个切片至少取5个区域，每个样品需500个以上肌纤维。用Image-Pro Plus 6.0分析软件分析Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型肌纤维的面积和直径，每个切片至少取5个区域。

采用SPSS 20.0及Microsoft Excel 2010软件对试验数据进行统计分析，结果以平均值±标准差表示；对各项指标进行Duncan’s分析，采用SPSS皮尔逊(Pearson)法进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 各部位牛肉肌纤维类型组成

2.1.1ATP酶法分析各部位牛肉肌纤维类型组成典型的ATP酶组织化学法碱染色(pH值9.45)照片见图1，除腰大肌放大倍数为10×40倍外，其他均为10×10倍，图中标尺为25 μm。图中ⅡB型肌纤维、ⅡA型肌纤维、Ⅰ型肌纤维的颜色由深到浅。从图中可以看出，各部位肉的肌纤维类型组成差别较大，大部分部位牛肌肉由3种肌纤维类型组成，但组成比例及面积和直径有差异；而冈下肌没有ⅡA型肌纤维，菱形肌几乎没有ⅡB型肌纤维，腰大肌的肌纤维面积和直径明显小于其他部位肉的肌纤维面积和直径，且从照片看腰大肌的肌纤维之间间隙较大，说明其结构较松散。通常认为肌纤维总数在动物出生后基本保持不变，但肌纤维类型在生长过程中持续相互转化，且其转化是环境等外界因素和机体内部因子协同调控的结果。动物出生时主要以氧化型肌纤维为主，一些肌纤维在生长过程中具有由氧化型向酵解型转化的能力，一些后天因素会导致肌纤维类型整体由氧化型向酵解型转化，且早期生长阶段是肌纤维类型转变的重要阶段[26]。总体来说，在动物的成长过程中，肌纤维遵循以下路径发生类型的转化：Ⅰ↔ⅡA↔ⅡX↔ⅡB[27-28]。而低甲状腺激素水平和长期耐力训练可能会导致肌纤维类型由快肌向慢肌转化，即按照ⅡB↔ⅡX↔ⅡA↔Ⅰ的方向转化[29-30]。本研究的结果也表明，新疆褐牛的不同部位肉肌纤维类型组成存在较大的差异，这与学者对其他动物的研究结果相一致[23,31-32]。

图1 各部位肉ATP酶染色照片Fig.1 Pictures of various beef cuts stained for ATPase reactivity

对新疆褐牛不同部位肉的各肌纤维类型数量进行分析，结果见图2。可以看出不同部位肌肉间肌纤维类型的组成显著不同(p<0.05)，最为典型的是冈下肌和菱形肌，冈下肌由Ⅰ型肌纤维和ⅡB型肌纤维组成，且数量比与其他部位肉差异显著(p<0.05)；菱形肌基本上由ⅡA型肌纤维和Ⅰ型肌纤维组成，ⅡB型肌纤维仅占到2.12%，ⅡB和ⅡA型肌纤维的数量比均与其他部位肉差异显著(p<0.05)。从各部位肉的主要肌纤维类型来分析，半腱肌和背最长肌均以ⅡB型肌纤维为主要类型，分别占47.87%和40.85%，而冈下肌、腰大肌、背阔肌和股二头肌以Ⅰ型肌纤维为主，分别占到79.69%、43.06%、42.63%和39.75%，菱形肌和腓肠肌则以ⅡA型肌纤维为主，分别占到61.43%和42.10%。其中半腱肌、背最长肌和腰大肌的肌纤维类型组成与郎玉苗[33]对西门塔尔牛这3个部位肌肉的研究基本一致。

图2 各部位牛肉肌纤维类型数量比Fig.2 Proportion of different muscle fiber types in various beef cuts

2.1.2各部位牛肉肌纤维面积和直径

由图3(图中不同字母表示同一肌纤维类型不同部位间差异显著，p<0.05，下同)可以看出，在各部位肉中，大部分以ⅡB型肌纤维面积最大，Ⅰ型肌纤维面积最小，ⅡA型肌纤维面积居中。8个部位相比较，菱形肌的ⅡA型肌纤维面积显著大于其他部位；菱形肌的Ⅰ型肌纤维面积最大，但与背最长肌和股二头肌没有显著差异；ⅡB型肌纤维面积最大的是背最长肌，但与半腱肌、背阔肌和股二头肌的ⅡB型肌纤维面积差异不显著；冈下肌的ⅡB型肌纤维面积显著小于其他部位；腰大肌的ⅡA型肌纤维显著小于其他部位；腰大肌的Ⅰ型肌纤维面积最小，但与腓肠肌和冈下肌的Ⅰ型肌纤维面积差异不显著。其中，股二头肌、菱形肌的肌纤维面积标准差较小，说明不同个体间的股二头肌肌纤维面积差异和不同个体间的菱形肌肌纤维面积差异均较小，而腰大肌、背最长肌的肌纤维面积标准差较大，说明不同个体间的腰大肌肌纤维面积差异和不同个体间的背最长肌肌纤维面积差异均较大。

图3 各部位牛肉肌纤维面积Fig.3 Cross-sectional area of different muscle fiber types in various beef cuts

结合各肌纤维类型单个肌纤维的面积和数量比，计算各部位肉不同肌纤维类型占整个部位肉横截面的面积百分比，结果见图4。冈下肌的Ⅰ型肌纤维占有绝对优势，菱形肌依然是ⅡA型肌纤维占据优势。半腱肌、腰大肌、背最长肌、背阔肌的ⅡB型肌纤维占到一半左右。而股二头肌的3种肌纤维类型面积百分比基本均分。腓肠肌的ⅡA型和ⅡB型面积百分比相当(约36%)，略大于Ⅰ型面积比。

图4 各部位牛肉不同肌纤维类型的面积百分比Fig.4 Area proportion of different muscle fiber typesin various beef cuts

各部位肉肌纤维直径见图5，与肌纤维面积的规律相类似。肌纤维直径最大的为菱形肌，其次为股二头肌、背最长肌、背阔肌、半腱肌，然后为腓肠肌、冈下肌、腰大肌。腰大肌的标准差较大，说明不同个体牛之间的腰大肌直径差异较大。

图5 各部位牛肉肌纤维直径Fig.5 Diameter of different muscle fiber types in various beef cuts

2.1.3MyHC基因表达量

图6表明，冈下肌的Ⅰ型MyHC基因表达量显著高于其他部位，而菱形肌的Ⅱa型MyHC基因表达量显著高于其他部位，Ⅱx型MyHC基因在半腱肌、腓肠肌和腰大肌中有比较突出的表达。Ⅱb型MyHC基因在8个部位肉中均没有表达，这与早期对牛骨骼肌的研究结果相一致[34-35]。

图6 各部位牛肉MyHC基因相对表达量Fig.6 MyHC expression in various beef cuts

文献[36]对18～24月龄公牛的背最长肌、咬肌、膈、眼外肌等10个部位进行研究，仅在眼外肌中发现了MyHCⅡb型基因的表达，而PICARD等[7]对22头公牛的半腱肌和背最长肌进行研究，仅在5头中发现MyHCⅡb型基因的表达。国内研究者对西杂牛背最长肌、半腱肌和比目鱼肌的研究[37]以及文献[8]利用LC-MS/MS和免疫组化两种方法对牛背最长肌的研究均没有发现MyHCⅡb型基因的表达。文献[38]在马的臀中肌中也未发现MyHCⅡb亚型的表达。因此研究者曾假设Ⅱb型作为MyHC的最快同型仅在小型哺乳动物中表达的原因是其相对于大型哺乳动物具有较快的肌肉收缩[30]，而牛和马科动物更适于慢氧化条件[39]。对比本研究与其他文献的结果进一步说明，不同品种不同年龄不同部位牛肉的肌球蛋白重链亚型表达存在差异。

图7为各部位肉中不同类型MyHC基因表达所占的百分比，其中菱形肌、冈下肌和背阔肌3个部位的Ⅱx型只有少量表达，而菱形肌的Ⅱa型占到84.20%，冈下肌和背阔肌的Ⅰ型和Ⅱa型基本呈均分模式。腰大肌和半腱肌的MyHC基因表达以Ⅱx为主，分别占到60.95%和63.07%；腓肠肌的整体表达模式与腰大肌和半腱肌类似，Ⅱ型MyHC基因占到90%。背最长肌和股二头肌的3种基因表达百分比分配类似，Ⅱx和Ⅱa占到30%～40%，Ⅰ型所占百分比低于30%。所取8个部位肉在牛胴体的位置从前躯到后躯分别按照以下顺序排列：前躯的菱形肌和冈下肌；中躯的背阔肌、背最长肌和腰大肌；后躯的股二头肌、半腱肌和腓肠肌。可以推测在新疆褐牛中，MyHC基因表达模式可能与部位肉所处的躯体位置存在极大相关性，如作为前躯的菱形肌和冈下肌，以Ⅰ型和Ⅱa型为主，Ⅱx型的表达比例极少；后躯的股二头肌、半腱肌和腓肠肌，Ⅰ型的表达比很少，以Ⅱ型为主。这可能与前中后躯不同部位肌肉的生理功能不同相关，MyHC基因表达模式与部位肉所处躯体位置的具体关系有待更深入的研究。

图7 各部位牛肉MyHC基因相对表达百分比Fig.7 Percentage of MyHC expression in various beef cuts

2.2 两种方法肌纤维类型的相关性

对新疆褐牛各部位肉肌纤维类型组成和MyHC基因型的相对表达量做相关性分析，结果列于表2。MyHCⅠ型基因的表达量与Ⅰ型肌纤维的数量百分比和面积百分比均呈极显著正相关关系。MyHCⅡa型基因的表达量与ⅡB型肌纤维的数量百分比和面积百分比均呈极显著负相关关系；与ⅡA型肌纤维的数量百分比和面积百分比均呈正相关关系，但相关性不显著。

表2 两种分型方法肌纤维类型的相关性Tab.2 Relativity between muscle fiber types and MyHC expression

Ⅰ型MyHC基因的表达百分比与Ⅰ型肌纤维的数量百分比和面积百分比均呈显著正相关关系。Ⅱa 型MyHC基因的表达百分比与ⅡB型肌纤维的数量百分比和面积百分比呈极显著和显著负相关关系；与ⅡA型肌纤维的面积百分比均呈显著正相关关系。Ⅱx 型MyHC基因的表达百分比与ⅡB型肌纤维的数量百分比和面积百分比均呈显著正相关关系。这说明Ⅰ型MyHC基因与Ⅰ型肌纤维存在对应关系，而RT-PCR法确定的Ⅱx 型MyHC基因极有可能与ATPase法确定的ⅡB型肌纤维相对应。

综上结果表明，在新疆褐牛中MyHC基因型表达与ATPase法确定的肌纤维类型之间存在一定的相关性，在确定MyHCⅠ型基因与Ⅰ型肌纤维时两种方法所得结果一致，而在确定Ⅱ型肌纤维和MyHCⅡ型基因时两种方法所得结果并不完全一致。

2.3 组织蛋白酶B、L、H活性的变化

图8～10分别为新疆褐牛各部位肉宰后成熟过程中组织蛋白酶B、H、L活性的变化。从图中可以看出，3种组织蛋白酶活性基本遵循随着宰后成熟时间的延长先增大，然后又降低的规律。这是因为组织蛋白酶存在于溶酶体中，在活体组织中并不呈现活性，机体死亡后，溶酶体遭到破坏，组织蛋白酶逐渐释放到细胞溶质中，表现为活性的逐渐升高，而在接触到底物进而发挥作用后活性又呈现出逐渐降低的趋势。文献[40]对青海牦牛宰后成熟8 d内的组织蛋白酶活性变化研究结果表明，组织蛋白酶B、H、L活性在8 d内呈现持续上升趋势，与本文对新疆褐牛的研究结果基本一致。

图8 牛肉宰后成熟过程中组织蛋白酶B活性的变化Fig.8 Change of cathepsin B’s activity during postmortem

不同部位肉的组织蛋白酶活性存在差异，宰后不同成熟时间的变化也有所不同，但变化规律基本一致。冈下肌的组织蛋白酶B活性最高，且与其他部位肉的活性存在显著差异，其活性在第9天时达到最大值，然后逐渐降低；绝大部分部位肉的组织蛋白酶B活性在宰后成熟第9天或第11天时达到最大值，除背最长肌外，其他部位肉在第9天和第11天时无显著差异。而背阔肌的组织蛋白酶B活性在第3天时即达到最大值，从第7天到第11天无显著性变化，第14天时又上升到第3天的活性水平。腰大肌的组织蛋白酶B活性处于持续上升趋势，在第14天时达到最大值。这说明不同部位肉溶酶体膜破裂、组织蛋白酶释放出来的速度不同，而14 d后组织蛋白酶的变化情况还有待进一步研究。

新疆褐牛各部位肉的组织蛋白酶H活性较低，说明组织蛋白酶H在牛肉宰后成熟过程中所起的作用可能很小，可以忽略不计[21]。

图9 牛肉宰后成熟过程中组织蛋白酶H活性的变化Fig.9 Change of cathepsin H’s activity during postmortem aging of beefaging of beef

宰后成熟过程中组织蛋白酶L活性变化规律与B相似，除腰大肌外其他各部位肉在第9天或第11天时达到最大值，而腰大肌的组织蛋白酶L活性则呈持续上升趋势，在第14天时达到最大。冈下肌的组织蛋白酶L活性也显著高于其他部位肉。新疆褐牛肉中，组织蛋白酶L活性明显高于B和H，以各部位的活性最大值计算，组织蛋白酶L活性是B的2.5～4倍，是H的10倍多甚至20倍，文献[25]对牦牛肉的研究表明组织蛋白酶 L降解肌球蛋白的能力是组织蛋白酶B的10倍，在牛肉的宰后成熟过程中发挥着重要作用。这可能是由于组织蛋白酶B和H会因水洗处理受到损失，而L相对稳定，不易损失，所以组织蛋白酶L在降解肌球蛋白重链方面起更大的作用[41]，它能快速降解肌钙蛋白T和I，也能缓慢分解肌联蛋白、伴肌动蛋白、α-辅肌动蛋白、原肌球蛋白、肌动蛋白、重酶解肌球蛋白和轻酶解肌球蛋白[42]。同时牛肉成熟3 d以后肌肉的pH值基本保持在5.5～5.7，与组织蛋白酶L的最适pH值接近，从而使其能够达到最大活力[43]。

图10 牛肉宰后成熟过程中组织蛋白酶L活性的变化Fig.10 Change of cathepsin L’s activity during postmortem aging of beef

2.4 肌纤维类型数量比和面积比与组织蛋白酶活性的相关性分析

肌纤维类型的数量比和面积比分别与组织蛋白酶活性及活性变化率做相关性分析，结果如表3～5所示。组织蛋白酶活性变化率以活性最大值与初始值相比较来计算。

表3 各类型肌纤维与组织蛋白酶B活性相关性Tab.3 Relativity between different muscle fiber types and cathepsin B’s activity

表4 各类型肌纤维与组织蛋白酶L活性相关性Tab.4 Relativity between different muscle fiber types and cathepsin L’s activity

由表3可以看出，ⅡB型肌纤维与组织蛋白酶B活性呈负相关关系，而ⅡB型肌纤维面积比与宰后9、11 d组织蛋白酶B活性以及组织蛋白酶B活性的变化率极显著或显著负相关。ⅡA型肌纤维数量比与组织蛋白酶B活性变化率呈显著负相关。ⅡA型肌纤维的面积比与宰后9 d时组织蛋白酶B活性呈显著正相关关系。Ⅰ型肌纤维数量比与组织蛋白酶B活性呈显著甚至极显著正相关关系，Ⅰ型肌纤维面积比也与宰后7～11 d组织蛋白酶B活性呈显著甚至极显著正相关关系。这说明，在新疆褐牛各部位肉中含有的Ⅰ型肌纤维越多、ⅡB型肌纤维越少，组织蛋白酶B活性就越高，越有助于宰后成熟过程中肉的嫩化。

肌纤维类型和组织蛋白酶L活性的相关性与肌纤维类型和组织蛋白酶B活性的相关性相类似，即ⅡB型肌纤维面积比与组织蛋白酶L活性呈负相关，而Ⅰ型肌纤维与宰后9、11 d组织蛋白酶L活性呈显著甚至极显著正相关。由于组织蛋白酶L活性是B活性的2.5～4倍，更有助于解释肌纤维类型与宰后成熟的关系。由此可推断在Ⅰ型肌纤维含量较高的牛肉中，由组织蛋白酶L参与降解的骨架蛋白在宰后成熟9 d以后的降解速度比ⅡB型肌纤维含量高的牛肉快。这一推断需要进一步试验验证。

由于组织蛋白酶H活性非常低，在进行与肌纤维类型的相关性分析时，除了与ⅡB型肌纤维数量比在宰后7 d时呈显著负相关关系外，与其他指标没有显著相关性，不具有参考价值。

3 结论

(1)新疆褐牛不同部位肉的肌纤维类型组成存在较大差异，最为典型的是冈下肌和菱形肌，冈下肌没有ⅡA型肌纤维，菱形肌则几乎没有ⅡB型肌纤维。对大部分部位的牛肉来说，ⅡB型肌纤维的横截面积和直径最大，Ⅰ型肌纤维的横截面积和直径最小。不同个体的腰大肌肌纤维横截面积和直径相差较大，说明相对于其他部位牛肉而言，在牛的生长过程中，腰大肌的肌纤维更易于受各种因素的影响。

(2)在新疆褐牛8个部位肉中，均未发现MyHCⅡb型基因的表达。MyHC基因的表达与各部位肉所处躯体的位置关系密切。两种分型方法在确定Ⅰ型肌纤维时所得结果一致，而ATPase法确定的ⅡB型肌纤维可能与 RT-PCR法确定的MyHCⅡx型相对应。

(3)组织蛋白酶L活性高，在宰后成熟中起重要作用。组织蛋白酶H活性非常低，在牛肉宰后成熟中的作用可以忽略。在宰后成熟过程中，3种组织蛋白酶活性基本呈现先增大、后减小的趋势，在宰后9～11 d时达到最大值。腰大肌的组织蛋白酶活性呈持续上升趋势，在宰后14 d后的变化仍需进一步研究。

(4)肌纤维类型与组织蛋白酶活性的相关性表明，各部位牛肉中Ⅰ型肌纤维比例越高，ⅡB型肌纤维比例越低，组织蛋白酶活性就越高，越有益于牛肉宰后成熟嫩化。