高效液相色谱-串联质谱法测定凉茶中20种非法添加化学药物

罗 伟，杜俊威，林秋凤，郑耀林，鄢 芸

(东莞市食品药品检验所，广东 东莞 523000)

凉茶源远流长，以中草药熬制的能消除暑气及内热而得名[1]。随着凉茶的开发应用，逐渐开发出了能舒缓感冒咳嗽、消炎镇痛的品种。在两广(广东、广西)地区流传着“没什么问题是一杯凉茶不能解决的”说法，可见民众对凉茶的喜爱。凉茶的配方及术语中蕴含了岭南人民的智慧和深厚文化底蕴，早在2006年被纳入国家级非物质文化遗产目录[2]。

随着“王老吉”和“加多宝”凉茶品牌的知名度越来越高，凉茶的市场也得到了极大拓展。在两广地区，散装凉茶铺随处可见，并形成了一些知名品牌。但是近年来，部分凉茶商家为了提高品牌的知名度和凉茶的功效，向自制凉茶中非法添加多类化学药物的新闻报道不断，如中山市凉茶抽检中发现对乙酰氨基酚含量高达1 679.2 μg/mL。凉茶的非法添加，药物剂量随意，多种混合，亦不注意配伍禁忌；销售时既无专业药师指导使用，又无用量限制。消费者在不知情的情况下，大量或长期饮用，可能会出现重复或过量用药的情况，易发生严重的药品不良反应，如致过敏样反应，肝、肾损伤等[3-4]。

目前，因凉茶的地域性，市售散装凉茶中非法添加化学药物的检测仍没有国家标准。凉茶样品基质复杂，其中所含的黄酮、多糖、有机酸和生物碱等，易干扰检测，非法添加分析难度较大[5-6]。采用应用于保健品或中成药检测的薄层色谱法或高效液相法，灵敏度和准确性不高[7]。检出阳性样品，仍需用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)确证[8-9]。

为了调研东莞市售凉茶的非法添加情况，于东莞各镇区共购买了200份不同品牌、不同功效的凉茶，主要有治疗风寒及风热感冒、清热祛湿、消炎止痛、止咳平喘等类别。对乙酰氨基酚、酮洛芬、异丙安替比林和萘普生有解热镇痛功效，马来酸氯苯那敏和盐酸苯海拉明抗组胺药物，多用于治疗过敏性鼻炎，磺胺甲噁唑、甲氧苄啶协同具有抑菌和杀菌作用，起到抗炎的效果[10]。张科明等[11]已采用LC-MS/MS测定凉茶中止咳平喘或解热镇痛类的化学药物。本研究针对20种化学药物，探索建立一种适用于各种功效的凉茶，便捷准确的分析方法。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

仪器：LC-20AD高效液相色谱仪(岛津公司)，3200 QTRAP质谱仪(AB SCIEX公司)，电子天平(Sartorius公司)，涡旋仪(Vortex公司)，超声提取仪(Branson公司)。

化合物标准物质：马来酸氯苯那敏(99.7%，批号：100047-200606)、地塞米松(99.6%，100129-201105)、对乙酰氨基酚(100%，批号：100018-200408)、泼尼松(100%，批号：100012-200706)、萘普生(100%，100198-201205)、磺胺甲噁唑(100%，100025-200904)、氨基比林(100%，100503-200301)、非那西丁(100%，100095-198904)、氢化可的松(100，100152-200206)、吡罗昔康(100%，100177-200603)、舒林酸(100%，100335-200001)、酮洛芬(100%，100337-0001)、萘丁美酮(100%，101003-200801)、异丙安替比林(100%，100525-200301)、甲氧苄啶(99.0%，批号：100031-200304)、枸橼酸喷托维林(100%，100432-200401)、盐酸苯海拉明(100%，100066-200807)、磷酸苯丙哌林(100%，100237-199701)、醋酸地塞米松(99.6%，100122-200805)均购自中检所，甲基泼尼松龙(99.4%，G168078)购自德国Dr Ehrenstorfer公司。

试剂：乙腈(批号：SHBK0734)、甲酸(批号：K3123 0964239)和甲醇(批号：I0945607812 )均为德国MERCK公司的色谱纯试剂。

样品：凉茶样品购自东莞市各区，同品牌同功效凉茶采集1份样品，包括癍沙、热感咳茶、特效口腔茶、清开灵茶、感冒茶、止咳化痰茶等市面常见品牌、品种，及少数凉茶店自配方自命名的凉茶样品200份。

1.2 实验条件

1.2.1 标准溶液的配制 20种化学药物的标准物质，分别按照说明书要求进行烘干等前处理，准确称取约10 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇-乙腈(1∶1，v/v)溶解后定容，制成浓度为1.0 mg/mL的标准储备液，取储备液各1 mL至同一100 mL容量瓶中，配成10 μg/mL混合标准溶液。置于-18 ℃环境中。

临用时，取恢复至室温的混合标准溶液，用乙腈-甲醇(1∶1)及色谱的流动相逐级稀释成500 ng/mL、250 ng/mL、200 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL、30 ng/mL、20 ng/mL、10 ng/mL浓度的混合标准工作溶液，用于考察方法的灵敏度，各化学成分的线性范围，绘制标准曲线。

1.2.2 样品处理 样品制备：市面上购买的凉茶样品，贮于4 ℃，测定时，准确吸取恢复至常温的凉茶样品10 mL于50 mL容量瓶，加30 mL甲醇-乙腈(1∶1)，超声30 min后定容。准确吸取上述溶液5mL至10 mL容量瓶中，流动相B定容，摇匀，0.22 μm滤膜滤过后上机。

空白试验，除不加试样外，均按供试品的制备步骤进行。

1.2.3 色谱条件 用Waters Atlantic T3柱(2 mm×100 mm，3 μm)进行分析，洗脱条件见表1。柱温35 ℃，进样量 10 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序

1.2.4 质谱条件 电离子喷雾正离子模式(ESI+)，多反应监测(MRM)；雾化气(GS1)50 psi，辅助气(GS2)50 psi，电离电压 5.5kV，离子源500 ℃。各化合物的采集参数见表2。

表2 20种化学药物的质谱优化参数及保留时间

50 ng/mL混合标准工作溶液检测结果见图1。各组分的分离度、信号响应均比较高。

图1 20种化学药的总离子流

2 结果与分析

2.1 预处理及色谱条件优化

2.1.1 预处理方法选择 凉茶以中草药为基础原料，在熬制过程中溶解出多糖、鞣质、色素、氨基酸、生物碱及黄酮等复杂混合成分[12]。先盐析脱水，再加入C18粉末，PSA做吸附剂进行分散固相萃取，取上清液进行检测。因20种化学药物品类不同，极性及机构差异大，经固相萃取部分目标成分含量损失较大。本方法针对的目标成分比较多，使用类极性质子溶剂和级性非质子溶剂乙腈-甲醇(1∶1，v/v)稀释样品。经测试多品牌不同品种的凉茶样品，目标峰处未见干扰，回收率得到了提高，极大精简了前处理步骤和耗材，检验周期短，经济便捷，专属性强，可根据出峰时间及离子对比例，定性非法添加物质。

各类中成药、保健品及功能性食品为达到宣称的疗效，其中非法添加外源性化学药物的含量，通常添加量较高[13]，如对乙酰氨基酚，一次服用量达到300～600 mg，才能起退烧作用。所添加的外源化学药物的起效剂量，经以上步骤稀释后，浓度能落在液相-质谱(LC-MS)定量的数量级范围内。方法的检出限能满足凉茶非法添加外源性化学药物的检测需求。

2.1.2 加标回收和精密度实验 流动相的优化：为缩短检测时间，优化峰形，提高分离度，对比了各类常用流动相体系，0.1%甲酸水、0.1%乙酸水、0.02 mol /L乙酸铵溶液，分别组合乙腈、甲醇，上机检测，发现使用甲醇有机相的流动相体系会使对乙酰氨基酚色谱峰形前延及变宽，氨基比林峰形钝；水相含有甲酸、乙酸的流动相中甲氧苄啶洗脱不完全，对乙酰氨基酚峰形无改善，其他组分峰形出峰时间延长。0.02 mol /L乙酸铵溶液(pH=4.2)能有效改善目标成分峰的分叉及拖尾状况，配合乙腈，分离度及峰形改善。实现了16 min内20种目标成分良好分离。

色谱柱的选择：分别用相同粒径的Luna C18及Waters Atlantic T3柱进行实验，考察其对20种目标成分的分离效果。发现Luna柱的基线噪音大，目标峰峰形宽、响应低的状况。Atlantic waters T3柱的分离度、峰形及响应较好。

2.2 方法的线性、灵敏度、回收率和精密度试验

2.2.1 检测方法的线性及灵敏度试验 取按“2.2.1”步骤制备的系列标准溶液，按上述高效液相-串联质谱的条件进样测定。以各组分的上机浓度为横坐标，表2中定量离子对的质谱响应峰面积为纵坐标，用外标法绘制标准曲线。各类组分的响应高低不同，检出限 1～30 mg/mL，定量限5～50 mg/mL。线性依据其定量限的高低进行确定，结果20种化学药物在各自的线性范围内，峰面积与测得浓度线性良好，相关系数在 0.996 2～1.000 0之间。线性范围、曲线和相关系数见表3。

表3 20种化学药物的线性范围、校准曲线、相关系数(R2)、检出限和定量限

2.2.2 回收率和精密度试验 阴性凉茶样品高、中、低水平添加，各浓度制备6份平行的阳性样品，按步骤处理，考察回收率和精密度，结果见表 4。样品中各化学药物的加标回收率在88.13%～114.60%之间，相对标准偏差(RSD)在1.18%～9.00%之间。

2.3 凉茶样品的测定

测定从东莞市各镇区凉茶店及市场购买的各品牌不同功效的散装凉茶共200份的添加情况。所有样品中均未检出以上20种化学药物。

3 结论及讨论

本项目主要研究凉茶中非法添加各类化学药物测定的方法，并对本市市售凉茶的非法添加情况进行摸底。优化预处理方法、色谱、质谱条件，完善针对20种可能非法添加于凉茶的具功效的化学药物的定性定量检测方法。预处理样品过程中，比较了多种固相萃取的填料和方法，但目标成分损失大、回收率低，无法兼顾各类目标化学物。已有报道的非法添加含量高，质谱的方法检出限较低，回归了最直接的溶解稀释方法，能满足监管的分析需求。

表4 阴性凉茶样品中20种化学药物的加标回收率及相对标准偏差

此分析测定方法的方法学验证结果符合凉茶样品的分析要求。凉茶样品只需要经简单的稀释过滤两步前处理步骤，即可上机定性定量，简化了分散固相萃取及固相小柱净化的繁琐步骤，节约了固相萃取的耗材及有机试剂的使用。方法应用性广、分析周期短。研究过程中应用此方法实际检测200份不同种类的凉茶样品，测定的目标成分种类多、范围广，可应用于市售散装凉茶中非法添加的化学药物的快速筛查和测定，为市售凉茶的质量安全监管提供技术支持。

凉茶样品的购样测定结果显示，本市区域的品牌凉茶店的凉茶中，非法添加状况较少。2013年本市出台了《凉茶店管理暂行办法》，暂行办法的有效期至2017年10月31日，暂行办法中强调了对全市凉茶店的监管，并规定凉茶需要当天制作和销售。但是市售凉茶，特别是路边及流动摊贩，在销售时，可能存在针对消费者描述症状，临时添加化学药的情况。

促进凉茶文化的发扬光大，需要保障凉茶的质量安全，可通过以下方式：散装凉茶应要求凉茶销售商家注明凉茶的原料，并提示凉茶为食品，不能代替药品，使消费者获取更多的商品信息；加强消费者的意识，开展群众监督，引导消费者维护自身合法权益；在凉茶销售的旺季，如夏季，进行市售凉茶的专项检查，控制食品卫生风险；各凉茶生产、销售单位需建立详细台账和人员管理制度，对凉茶原料进行有效溯源和控制，保留从具备合法经营资质的单位购买原材料的购买凭证和供应方证照，并配备食品安全管理人员；完善市售凉茶备案制度，凉茶生产单位对凉茶种类及配方进行备案，不添加未经批准为药食同源的中草药及凉茶目录之外的原料，不生产经许可的目录之外的产品；通过扩大覆盖面、突击抽检等方式进行有效监管。