牛源无乳链球菌的耐药率调查及其耐药机制研究进展

李明，赵艳坤，陈贺，李建洲，邵伟

（1.新疆农业大学动物科学学院/新疆肉乳用草食动物营养实验室，乌鲁木齐 830052；2.新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/农业农村部农产品质量安全风险评估实验室/新疆农产品质量安全实验室，乌鲁木齐 830091）

奶牛乳房炎是奶牛养殖业面临的一大难题。病原微生物是引起奶牛患乳房炎的主要原因，其中无乳链球菌（S. agalactiae）又是引起奶牛隐性乳房炎的主要病原。无乳链球菌具有高度传染性，能造成乳腺组织慢性感染，最终导致奶牛产奶量下降甚至无乳[1]，导致高产牛淘汰，还会传染给犊牛，给奶牛场造成巨大的经济损失。目前，抗菌药是治疗奶牛乳房炎最常用的药物。由于滥用抗菌药，导致很多药物对乳房炎疗效变差，并且这些抗菌药会对菌株进行选择，有增加细菌耐药性趋势[2]，使得无乳链球菌耐药情况越来复杂。目前人们对无乳链球菌的耐药性和耐药机制领域研究较少，主要集中在人源、鱼源等无乳链球菌的耐药性上。笔者就近十年国内外有关无乳链球菌的耐药率及其机理的研究概况进行综述，以期找到奶牛乳房炎耐药现状及其规律，为无乳链球菌引起奶牛乳房炎的常用药提供理论参考。

1 无乳链球菌的耐药性研究现状

1.1 国外无乳链球菌的耐药现状

在国外，北美和欧洲的一些地区，通过制定特定控制程序来减少引起传染性乳房炎的一些因素，无乳链球菌引起的乳房炎已经变得少见[3,4]。在其他地区，如南美某些国家，无乳链球菌仍然是乳房内细菌感染的一个重要原因。例如在哥伦比亚奶牛群中，有28%～35%的乳房内细菌感染是由无乳链球菌引起的[5]；在巴西，Tiago Tomazi等[6]最近的一项研究报告称，无乳链球菌是导致20个奶牛群患临床型乳房炎的第三大流行细菌之一。目前国外对人源无乳链球菌的研究较多，本数据主要由人源和牛源无乳链球菌耐药率组成。从表1中可以看出近10年（2009-2018年）国外12种常用于治疗无乳链球菌的抗菌药耐药情况。表中结果显示，通过对不同地区、不同年份进行无乳链球菌耐药性检测，其中从单地区来看：对美国、孟买、埃塞俄比亚各地区的β-内酰胺类、大环内酯类、林可胺类、氨基糖苷类、四环素类、喹诺酮类、磺胺类7种抗菌药耐药性进行检测，美国有1种抗菌药即四环素（TET）的耐药率≥50%，孟买有2种抗生素即链霉素（STR）和TET的耐药率≥50%，埃塞俄比亚没有抗菌药耐药。对阿根廷、巴西6种抗菌药耐药性进行检测发现，阿根廷没有抗菌药耐药，巴西有1种抗菌药（TET）耐药，耐药率≥50%。对波兰、伊朗、加拿大各地区的5种抗菌药耐药性进行检测，发现波兰、伊朗、加拿大地区TET的耐药率均≥50%。

从多个地区来看：对约旦、巴西（简称2a地）和喀麦隆、埃及（简称2b地）的8种抗生素耐药性进行检测，2a地有4种抗生素即青霉素（PEN）、STR、TET和复方新诺明（SXT）的耐药率≥50%，耐药情况很严重；2b地没有抗生素耐药。

从时间轴上来看，不同国家的无乳链球菌耐药情况如下（以耐药率≥50%的次数表示耐药的严重性）：PEN类耐药情况不严重，17次中有1次抗菌药耐药率≥50%；头孢类耐药情况不严重，3次中有0次抗菌药耐药率≥50%；大环内酯（ERY）耐药情况不严重，9次中有0次抗菌药耐药率≥50%；林可胺类耐药情况不严重，9次中有0次抗菌药抗生素耐药率≥50%；氨基糖苷类耐药情况严重，6次中有2次抗菌药抗生素耐药率≥50%；四环素类耐药情况很严重，10次中有7次抗菌药抗生素耐药率≥50%；喹诺酮类耐药情况不严重，6次中有0次抗菌药抗生素耐药率≥50%；磺胺类耐药情况不严重，4次中有1次抗菌药耐药率≥50%。

由此国外可以选用β-内酰胺类、头孢类、林可胺类、喹诺酮类抗生素治疗奶牛乳房炎 。

1.2 国内无乳链球菌的耐药现状

目前国内对人源性、鱼源性无乳链球菌的研究较多，通过14种常用于治疗无乳链球菌的抗生素耐药率统计分析可以了解其耐药的研究现状。但对于奶牛乳房炎无乳链球菌的耐药性及耐药基因报道的较少，而我国奶牛乳房炎发病率又很高，据报道临床型乳房炎发病率为9.7%～55.6%，隐性乳房炎发病率为61.03%～79.62%[29]，故暂且以人源、鱼源无乳链球菌耐药率的数据进行分析。

表2显示了对不同地区、不同年份进行无乳链球菌耐药性检测的结果，其中从单地区来看：对云南10种抗菌药耐药性进行检测，有4种抗菌药即氨苄青霉素（AMP）、青霉素G（PG）、ERY、CLI（克林霉素）耐药率≥50%；对新疆、长春8种抗菌药耐药性进行检测，新疆有2种抗菌药（TET、SXT）耐药率≥50%，长春有2种抗菌药即庆大霉素（GM）、卡那霉素（K）耐药率≥50%。上海、黑龙江、内蒙古、甘肃地区对7种抗菌药耐药性进行检测，上海有3种抗菌药（AMP、GM、TET）耐药率≥50%；黑龙江有2种抗菌药（AMP、CLI）耐药率≥50%；内蒙古有2种抗菌药（ERY、TET）耐药率≥50%；甘肃有3种抗菌药（AMP、ERY、CLI）耐药率≥50%。对北京、江苏5种抗菌药进行检测，北京、江苏均有2种抗菌药（ERY、CLI）耐药率≥50%。

表1 2009-2018年国外无乳链球菌对临床适用12种抗菌药物的耐药结果[7～16]

表2 2009-2018年国内无乳链球菌对临床使用14种抗菌药物的耐药结果[17～28]

从多个地区来看：对兰州、天津、重庆、青岛和西安等（简称多地a）的13种抗菌药耐药性进行检测，有5种抗菌药（AMP、PG、STR、CIP、SXT）耐药率≥50%，耐药情况比较严重。对甘肃、山西、青海、浙江、江苏和河北等（简称多地b）的7种抗菌药耐药性进行检测，有1种抗菌药（K）耐药率≥50%。对上海、黑龙江、内蒙古、河北、山东（简称多地c）8种抗菌药耐药性进行检测，没有抗菌药耐药。

从时间轴上来看，青霉素类耐药情况严重，19次中8次抗菌药耐药率≥50%；头孢类耐药情况不严重，15次中有0次抗菌药耐药率≥50%；大环内酯类（ERY）耐药情况不严重，15次中有4次抗菌药耐药率≥50%；林可胺类耐药情况严重，15次中5次抗菌药耐药率≥50%；氨基糖苷类耐药情况不严重，20次中有5次抗菌药耐药率≥50%；TET类耐药情况不严重，15次中有3次抗菌药耐药率≥50%；喹诺酮类耐药情况不严重，16次中1次抗菌药耐药率≥50%；磺胺类耐药情况不严重，9次中2次抗菌药耐药率≥50%，由此国内可以选用头孢类、大环内酯类、氨基糖苷类、四环素类、喹诺酮类、磺胺类抗菌药治疗无乳链球菌。

表1与表2对比可知，就青霉素类而言，国内无乳链球菌对β-内酰胺类抗菌药的耐药比国外严重。国内PEN耐药率高，不建议用青霉素类治疗乳房炎；国外PEN类耐药率低，可用PEN治疗乳房炎。就头孢菌素类而言，国内无乳链球菌对头孢类、大环内酯类、林可酰胺类抗菌药的耐药严重性高于国外，但可用于治疗乳房炎。氨基糖苷类的耐药严重性国内略高于国外，国内外都可用于治疗乳房炎。TET类的耐药严重性略低于国外，国内可用于治疗乳房炎，国外应减少四环素类对无乳链球菌的治疗。喹诺酮类的耐药性国内与国外几乎相同，都不严重，可用于治疗乳房炎。国内磺胺类抗菌药的耐药严重性低于国外，国内外磺胺类药物可用于治疗乳房炎。

2 无乳链球菌对抗菌药物的耐药机制研究现状

无乳链球菌隶属于链球菌属，是一种革兰氏阳性细菌，按照血清学分类法将无乳链球菌归为B群，因此无乳链球菌又称B群链球菌（人医又称其为GBS）[30]。无乳链球菌的耐药机制国内外报道较少，其与链球菌的耐药机制相似。

2.1 无乳链球菌对β-内酰胺类抗菌药物的耐药机制

由表2知，无乳链球菌对青霉素类耐药性强。β-内酰胺类抗生素杀菌机理是通过β-内酰胺环与细胞壁 化合成酶，即青霉素结合蛋白（PBPs）丝氨酸活化位点共价结合，使细胞壁 肽合成受到阻碍，从而导致细胞壁的缺损，菌体因膨胀而裂解[31]。而耐药机制主要有以下两种：

（1）产生β-内酰胺酶。链球菌质粒或染色体突变，能够产生β-内酰胺酶来降解抗生素，使β-内酰胺环遭到破坏，使β-内酰胺类抗生素在到达靶作用部位之前就失去了活性[32]。

（2）青霉素结合蛋白（即PBPs）的变异。PBPs的变异使链球菌与药物的亲和力降低，从而发生耐药，还有PBP的含量发生变化或缺失也可发生耐药。诱导性PBPs的出现，可不依赖β-内酰胺酶的存在而对β-内酰胺类抗生素耐药，称内在或固有耐药；细菌可产生缓慢结合的PBPs，这种由PBP介导的耐药性在革兰氏阳性菌中更常见，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐青霉素肺炎球菌[33]。

2.2 无乳链球菌对大环内酯类抗菌药物的耐药机制

无乳链球菌对大环内酯类耐药性强，其耐药机制主要有如下三种：

（1）靶位改变。产生耐药性的链球菌通过合成由ermB、ermF基因编码的核糖体甲基化酶erm，使与大环内酯类抗菌药物结合的23S rRNA特定腺嘌呤甲基化，阻止药物与核糖体的结合[34]。

（2）主动外排系统作用。产生耐药性的链球菌通过mef基因和MsrD[35]基因介导产生耐药性，mef和MsrD能够编码跨膜区域的能量依赖的膜外排蛋白，依靠质子运动力泵出14,15元环大环内酯类抗菌药[36,37]。

（3）23S rRNA和核糖体蛋白L4和L22突变。大环内酯类药物的结合域主要由23S rRNA的V区和II区以及核糖体蛋白L4和L22组成。核糖体蛋白L4和L22最初与23S rRNA的I区结合在一起，当L4和L22发生变异时会破坏大环内酯结合部位而导致对大环内酯类药物耐药[38]。

2.3 无乳链球菌对氨基糖苷类抗菌药物的耐药机制

无乳链球菌对氨基糖苷类耐药情况严重，氨基糖苷类抗生素结构相似，均是由2～3个氨基糖分子和非糖部分的苷元通过氧桥连接而成，因此交叉耐药性现象普遍存在。氨基糖苷抗性相关的基因有addE和aphA-3，主要编码6-腺苷酰(基)转移酶( AAD ( 6') ) 和3-磷酸转移酶(APH( 3' ) -Ⅲ)，分别可导致STR、K和新霉素耐药[39]。耐药的无乳链球菌以产生钝化酶为主，即抗生素分子中的某些保持抗菌活性所必需的基团(羟基或氨基)经酶修饰后与其作用靶位核糖体结合的亲和力下降，不能进入发挥抗菌活性阶段[40]。

2.4 无乳链球菌对四环素类抗菌药物的耐药机制

无乳链球菌对四环素耐药情况较严重，以下是链球菌对TET类抗菌药物的耐药机制：

（1）tetM、tetO、tetS是编码核糖体保护蛋白的基因，使TET无法与细菌核糖体结合而失去效能[41]。

（2）tetK、tetL基因与药物排出泵机制相关。药物排出泵是将细胞内的TET由导出泵排出细胞外，从而使TET无法发挥作用[42～44]。

（3）产生灭活或钝化TET酶的基因及其表达的蛋白。因tetX常与编码rRNA甲基化酶的ermF基因(介导ERY耐药)连在一起，这在克隆ermF时发现了tetX，tetX是唯一编码钝化或灭活TET酶的基因，它能编码约44ku胞质蛋白，在有氧呼吸和NADPH时对TET进行化学修饰[45]。

2.5 无乳链球菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药机制

无乳链球菌对喹诺酮类耐药情况不严重，但仍然有耐药菌。以下是链球菌对喹诺酮类药物耐药的机制：

（1）靶位突变。拓扑异构酶IV由2个ParC蛋白与2个ParD蛋白各组成一个四聚体，ParC与ParD由parC与parD基因分别编码。DNA旋转酶由gyrA和gyrB基因编码，A,B各2个亚基组成的蛋白四聚体，4个编码基因中任意一个发生变异均会引起喹诺酮耐药性。基因gyrA或parC的单一位点突变可导致细菌对喹诺酮类抗菌药低水平耐药，但高水平耐药的表达需要gyrA和parC双位点同时突变[46,47]。

（2）链球菌主动调控基因的突变导致主动外排系统的增强。个别报道关于喹诺酮类药物基因的突变发生在质粒上如qnr可编码喹诺酮耐药[48]。Zeller等[49]在体外筛选的对CIP低水平耐药的肺炎链球菌中首次观察到喹诺酮的耐药决定区没有发生突变，证明肺炎链球菌存在主动外排系统。

3 小结与展望

本文主要总结了2009-2018年国内外对人、鱼、牛等治疗无乳链球菌病中常用抗生素对无乳链球菌的耐药率，了解国内外无乳链球菌耐药现状及其变迁情况，并对无乳链球菌对β-内酰胺类、大环内酯类、林可胺类、氨基糖苷类、四环素、喹诺酮类和磺胺类7大抗菌药耐药性进行了简明扼要介绍。得知国内无乳链球菌对青霉素、大环内酯类、林可酰胺类、磺胺类耐药性强，存在着滥用现象，导致药物疗效变差，但可以用头孢菌素类、氨基糖苷类、四环素类、喹诺酮类抗生素治疗乳房炎。国外各地无乳链球菌主要对TET类产生严重的耐药性，说明国外农场大量使用TET，导致无乳链球菌对TET耐药严重，可以用除此之外的其他抗菌药治疗乳房炎。

从分子水平来看，无乳链球菌中存在结合转座子、噬菌体、质粒等在内的可移动遗传因素，使无乳链球菌耐药性越来越复杂，导致耐药基因在传染性病原体间广泛传播和流行。因此，应重点关注从分子水平深层探索无乳链球菌耐药机制，发现新的耐药基因，找出降低无乳链球菌耐药性的方法，避免抗菌药物的滥用，为奶牛乳房炎设计合理的临床治疗方案。