贵州省HPAIV和NDV免疫抗体检测及其R语言分析

陈国权，吴征卓，姚碧琼，施大军，张 旭，阎朝华，周碧君,3*，王开功,3，程振涛,3，文 明,3*

(1.贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 动物疫病研究所，贵州 贵阳 550025；3.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州 贵阳 550025；4.三穗县鸭产业化建设管理办公室，贵州 三穗县 556500；5.贵州千里山生态食品股份有限公司，贵州 三穗县 556500)

禽流感(avian influenza,AI)是由A型流感病毒(avian influenza virus,AIV)引起禽类呼吸道或全身性感染的一种急性传染病[1-2]。AIV可感染人、家禽、野生鸟类和部分哺乳动物等[3]。根据AIV对鸡的致病性，可将AIV分为高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus,LPAIV)[4]。世界卫生组织(OIE)将HPAI列为法定报告的动物疫病，中国也将其列为一类传染病[5]。目前发现仅有部分H5和H7亚型AIV可引起HPAI，且这些亚型的病毒也能感染人，影响公共安全[6]。AIV在全球范围内传播，扩散到家禽中并引起人类的人畜共患感染，并给人类带来经济、健康、种族和社会问题[7]。新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一种禽类急性高度接触性病毒性传染病[8]。NDV感染鸡最常观察到神经系统、呼吸系统、消化系统和生殖系统的病变[9]。NDV在世界各地流行，时有暴发，给全球养禽业造成严重的经济损失，被OIE列为必须报告的一类传染病[10]。目前没有有效治疗AI和ND的方法，家禽养殖者主要依靠严格的生物安全防控和疫苗接种来控制这2种暴发性疫病的传播[11]。

我国属于养禽大国，且大部分都是中小型养殖场和散养户。不同地区、不同温度、不同养殖方式和不同海拔对鸡群的免疫效果不同，若免疫失败会导致疫病的暴发。有学者已经报道了内蒙古自治区、黑龙江省、西安市和延安市等地区[12-15]不同养殖模式、不同季节和不同养殖地区免疫抗体水平的差异性，而贵州省关于免疫抗体水平差异性的分析还比较欠缺。为了解贵州省各地区H5,H7亚型AIV和NDV的免疫抗体水平及与养殖方式、温度和海拔等因素的相关性。本实验室通过收集2015—2018年贵州省9个市(州)294个养殖场(户)送检的11 017份鸡血清样本，以血凝抑制试验方法进行H5,H7亚型AIV和NDV免疫抗体水平检测，并使用易侕统计软件和R语言对不同地区、养殖方式、温度和海拔等因素对H5,H7亚型AIV和NDV的免疫情况的影响进行分析，为贵州省制定更科学的免疫程序和防控H5,H7亚型AIV和NDV提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病毒样品源于贵州省2015—2018年9个市(州)的294个养殖场(其中安顺市27个、贵阳市39个、铜仁市17个、遵义市31个、毕节地区27个、黔南州36个、黔东南州36个、黔西南州45个、六盘水市36个)已免疫H5,H7亚型AIV和NDV疫苗的鸡群，通过翅静脉采血约2 mL，静置30 min，4℃ 4 000 r/min，5 min并吸取血清置于1.5 mL无菌离心管中，标记血清来源的地区、养殖场规模、温度和海拔等信息。共收集血清样本11 017份，其中免疫H5,H7亚型AIV和NDV疫苗待检血清分别为6 534，1 341和3 142份。分别置于-20℃冰箱保存备用。

1.2 主要试剂AIV H5亚型(Re-8株)血凝抑制试验抗原和AIV H7亚型(H7N9株)血凝抑制试验抗原购自哈尔滨维科生物技术开发公司；NDV血凝抑制试验抗原购自哈尔滨动物生物制品国家工程研究中心有限公司。

1.3 血清抗体检测HPAIV H5,H7和NDV抗体均采用血凝抑制试验(HI)方法检测。HPAIV H5,H7抗体检测的具体操作参照国家标准《高致病性禽流感诊断技术》(GB/T 18936-2003)中的HI试验进行，HI抗体效价≥24，结果判定为合格；鸡新城疫抗体检测执行《鸡新城疫诊断技术标准》(GB/T16550-2008)，HI抗体效价≥25，结果判定为合格[16]。

1.4 数据统计根据国家标准中阴阳性判断标准判定不同地区、养殖方式、温度和海拔对H5,H7亚型AIV和NDV免疫抗体水平，采用易侕统计软件和R语言进行单因素和多因素分析，计数样本以份数表示，采用P值，单因素分析有统计学意义的则纳入多因素分析，采用线性回归模型进行多因素分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 贵州省各地区H5,H7亚型AIV和NDV疫苗免疫平均情况按照国家农业部动物疫病监测的标准，H5,H7亚型AIV和NDV免疫抗体阳性率≥70%，判定为群体免疫合格。采用血凝抑制试验方法对贵州省9个市(州)294个养殖场的H5,H7亚型AIV和NDV进行疫苗免疫抗体监测。结果显示，贵州省9个市(州)294个养殖场总体H5,H7亚型AIV和NDV的免疫抗体阳性率分别为84.80%(5 541/6 534)，64.95%(871/1341)和90.48%(2 843/3 142)，H5亚型AIV和NDV的免疫抗体阳性率达到国家农业部动物疫病监测的标准(图1)。

图1 贵州省9个市(州)H5,H7亚型AIV和NDV免疫抗体阳性率

2.2 不同地区对H5,H7亚型AIV和NDV疫苗免疫情况分析针对贵州省不同地区，采用易侕统计软件和R语言对294个养殖场的H5,H7亚型AIV和NDV疫苗免疫结果进行差异性分析。结果显示，H5,H7亚型AI免疫抗体阳性率在贵州省的不同地区中差异均极显著(P<0.01)，而对NDV疫苗免疫效果差异不显著(图2)。

2.3 不同养殖方式对H5,H7亚型AIV和NDV疫苗免疫情况分析针对各地区的不同养殖方式，采用易侕统计软件和R语言对294个不同养殖方式(其中规模化养殖场151个，散养户143个)的H5,H7亚型AIV和NDV疫苗免疫情况进行差异性分析。结果显示，不同养殖方式对H5亚型AIV的免疫效果影响差异显著(P<0.05)，而对H7亚型AIV和NDV的免疫效果影响不显著(图4)。表明养殖方式对贵州省各个地区的H5亚型AI的疫苗免疫阳性率有较大影响，而对贵州省各个市(州)的H7亚型AIV和NDV影响不大，养殖户可根据需要选择。

图3 不同养殖方式对H5,H7亚型AIV和NDV免疫抗体阳性率的影响

2.4 不同温度对H5,H7亚型AIV和NDV疫苗免疫情况分析针对各地区的不同温度，将暴露变量温度从连续变量转换为分类变量(根据温度不同分为3组：低值组(2～11℃)97个养殖场、中值组(12～18℃)89个养殖场、高值组(19～30℃)108个养殖场)，并比较不同温度之间的基线变异性。采用易侕统计软件和R语言对294个养殖场H5,H7亚型AIV和NDV疫苗免疫情况进行差异性分析。不同温度对H5,H7亚型AIV和NDV疫苗免疫情况差异统计结果显示，温度变化对H5亚型AIV的免疫效果影响差异极显著(P<0.01)，而对H7亚型AIV和NDV的免疫效果影响不显著(图4)。表明温度对贵州省各个地区的H5亚型AIV的疫苗免疫阳性率有较大影响。

图4 不同温度对H5,H7亚型AIV和NDV免疫抗体阳性率的影响

2.5 不同海拔对H5,H7亚型AIV和NDV疫苗免疫情况分析针对各地区的不同海拔高度，将暴露变量海拔高度从连续变量转换为分类变量,根据海拔高度不同分为3组：(低值组(257～996 m)98个养殖场、中值组(1 002～1 287 m)98个养殖场、高值组(1 288～2 338 m)98个养殖场。并比较不同海拔之间的基线变异性。采用易侕统计软件和R语言对294个养殖场H5,H7亚型AIV和NDV疫苗免疫情况进行差异性分析。不同海拔对H5,H7亚型AIV和NDV疫苗免疫情况差异统计结果显示，不同海拔对H5,H7亚型AIV和NDV疫苗免疫抗体水平影响差异不显著(P>0.05)(图5)。中海拔地区H7亚型AIV和NDV免疫抗体阳性率高于低海拔和高海拔地区，表明贵州省具备的天然海拔条件有利于H7亚型AIV和NDV的免疫防控。

图5 不同海拔对H5,H7亚型AIV和NDV免疫抗体阳性率的影响

2.6 多因素对H5,H7亚型AIV和NDV疫苗免疫情况分析采用线性回归模型对294个养殖场的H5,H7亚型AIV和NDV疫苗免疫情况与不同地区、养殖方式、温度和海拔等因素进行分析。结果显示，以安顺市H5亚型AIV疫苗免疫情况为参照对象，其他地区在近4年内H5亚型AIV疫苗抗体阳性率均低于安顺市；以规模化养殖场的H5亚型AIV疫苗免疫情况为参照对象，散养户的H5亚型AIV疫苗抗体阳性率显著低于规模化养殖场(P<0.05)；温度和海拔对H5亚型AIV疫苗免疫抗体阳性率的影响差异不明显。以安顺市的H7亚型AIV疫苗免疫情况为参照对象，除贵阳市和毕节地区外，其余地区的H7亚型AIV疫苗免疫抗体阳性率均低于安顺市；以规模化养殖场的H7亚型AIV疫苗免疫情况为参照对象，规模化养殖场比散养户H7亚型AIV疫苗免疫抗体阳性率高；温度和海拔对H7亚型AIV疫苗免疫抗体阳性率的影响差异不明显。以安顺市的NDV疫苗免疫情况为参照对象，其余地区的NDV疫苗免疫抗体阳性率均低于安顺市；以规模化养殖场的NDV疫苗免疫情况为参照对象，规模化养殖场比散养户NDV疫苗免疫抗体阳性率高；温度和海拔对NDV疫苗免疫抗体水平影响差异不显著(表1)。表明近4年以来H5,H7亚型AIV和NDV疫苗免疫抗体阳性率在各个地区均不稳定；养殖方式、温度和海拔对上述疫病的免疫效果影响不同。

表1 多因素对H5,H7亚型AIV和NDV免疫抗体阳性率的影响

3 讨论

H5,H7亚型AIV和NDV入侵贵州省的养禽业多年，造成了巨大的经济损失，疫苗免疫是所有防控措施中最有效的一种。从本次统计看，贵州省2015—2018年检测的H5,H7亚型AIV和NDV(共11 017份鸡血清)的免疫抗体阳性率分别为84.80%(5541/6534),64.95%(871/1341)和90.48%(2 843/3 141)，NDV免疫抗体阳性率高于H5和H7亚型AIV，且NDV和H5亚型AIV免疫抗体阳性率均达到国家农业部动物疫病监测的标准，仅H7亚型AIV免疫抗体阳性率未达到国家农业部动物疫病监测的标准，反映出贵州省养禽业免疫管理基本符合规范，在疫苗免疫工作方面取得了较好的效果。而铜仁市、黔南州、六盘水市和黔东南州的H7亚型AIV免疫抗体阳性率分别为14%(7/50),19.63%(21/107),39.53%(134/339)和59.38%(95/160)，六盘水市H5亚型AIV免疫抗体阳性率为65.18%(511/784)，这些地区的疫苗免疫抗体阳性率均未达到国家免疫标准，建议加强监测、及时补免。

通过对贵州省2015—2018年H5,H7亚型AIV和NDV免疫情况分析，发现不同地区的H5,H7亚型AIV和NDV免疫抗体差异较大，可能与各地区养殖方式、温度和海拔等因素相关。H5亚型AIV免疫抗体阳性率高于H7亚型AIV且规模场免疫抗体阳性率高于散养户，与徐佳等[13]报道黑龙江省禽流感免疫抗体监测与分析结果相符。不同养殖方式对H5亚型AIV的免疫效果影响差异显著(P<0.05)，而对H7亚型AIV和NDV的免疫效果影响无明显差异。规模化养鸡场的H5,H7亚型AIV和NDV免疫抗体阳性率均高于散养户，与康红等[18]报道分析进贤县鸡场H5亚型禽流感不同检测场抗体合格情况相符。按照温度分层，低温、中温和高温时H5亚型AIV免疫抗体阳性率分别为：85%,72%和89%；低温、中温和高温时H7亚型AIV免疫抗体阳性率分别为：63%,66%和77%；低温、中温和高温时NDV免疫抗体阳性率分别为90%,95%和87%。温度对H5亚型AIV免疫抗体阳性率的影响差异极显著(P<0.01)，冬季温度较低，免疫合格率较夏季低，提示应加强秋防免疫；而NDV免疫抗体情况刚好与H5,H7亚型AIV相反，春季免疫合格率较夏季和秋季低，与王娟娟等[18]报道的春防禽流感免疫抗体合格率高于秋防，而春防NDV免疫抗体合格率低于秋防相符。

贵州省的海拔高度由147.8 ～2 900.6 m不等，平均海拔在1 100 m左右。中海拔地区(1 002～1 287 m)H7亚型AIV和NDV免疫抗体阳性率明显高于低海拔和高海拔地区，表明贵州省具备的天然海拔条件有利于鸡H7亚型AIV和NDV的免疫防控。综合来看，温度和海拔对疫苗免疫效果的影响较大，贵州省H7亚型AIV免疫抗体不达标的地区主要是六盘水市和铜仁市。六盘水市因平均海拔最高，平均温度最低；铜仁市因平均海拔最低，平均温度最高，均不利于H7亚型AIV疫苗接种。因此在接种疫苗时，应把饲养温度控制在适宜免疫温度，并做到规范操作和严格的消毒处理，对疫苗、管理水平和饲养环境等方面进行全面监控，才能有效减少免疫失败或免疫副作用的产生。贵州省冬春季的温度明显低于夏秋季，在以后的免疫中应科学把控好免疫时间，本统计分析结果也符合国家“春防和秋防”的免疫方针，再次证实了该政策的科学性。

本研究通过R语言分析近4年来贵州省不同地区、养殖方式、温度和海拔对H5,H7亚型AIV和NDV等疫病的免疫抗体阳性率的影响，为贵州省制定适合于本省的免疫程序和防控鸡H5,H7亚型AIV和NDV提供理论依据。