气相色谱检测啤酒中十六种有机磷农药残留方法的建立

柴宗龙,钱滢文,袁彩霞,洪 霞,何海宁,王杰斌,张彦军

(1.甘肃省商业科技研究所有限公司,甘肃兰州 730010;2.甘肃中商食品质量检验检测有限公司,甘肃兰州 730010)

有机磷是结构中含有酯键的一类化合物,因其种类多、易降解、残留时间短而广泛应用于农作物病虫害防治中,其特点主要是高效性和广谱性[1-2]。有机磷通过机体乙酰胆碱途径引起中枢神经系统紊乱,导致机体无法正常运转;有机磷化合物也可通过非胆碱酯酶抑制机制影响机体的神经系统,使机体产生认知功能障碍[3-4]。虽然大多数有机磷农药残留期短、残留量少,但是有少数具有高毒和剧毒特性,如甲胺磷、对硫磷、甲拌磷等。马雯等[5]研究表明,长期接触低剂量的有机磷化合物会对人体产生生殖毒害和致癌的危害。因此,避免有机磷农药对机体健康的危害至关重要。

啤酒是世界上仅次于水和茶的第三大饮料[6-9]。啤酒的生产过程是以大麦、玉米等粮食作物为主要原料,加入啤酒花作为辅料,经过酵母发酵酿制而成[10-12]。Tomonori等[13]和Simn等[14]在文章中指出,加入啤酒花的啤酒中农药残留量显著高于未加入啤酒花的啤酒,说明啤酒中的农残有来自于辅料中残留。由于在啤酒酿造过程中原料和辅料中残留的农药难以彻底清洗干净,部分农药有存在于啤酒中的风险[15-18],对消费者的身体健康造成直接或潜在的危害[19]。因此,加强对啤酒中农药残留的检测具有重要意义。

目前,国内外有机磷农残检测方法有气相色谱法(Gas Chromatography,GC)、高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)、气相色谱-质谱联用法(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)、高效液相色谱-质谱联用法(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry LC-MS)[20-22]。对于HPLC法,大多数有机磷化合物对紫外光吸收不强,灵敏度不高,因此该方法对有机磷农残检测种类有较大限制,制约了其应用;GC-MS法和HPLC-MS法在检测有机磷农残时准确度和灵敏度都能够满足,但是其仪器昂贵,成本较高,且需要非常专业的人员维护,也不宜应用于基层企业。基于此,针对大多数有机磷化合物的性质,其受热易气化、热稳定性好,适用于GC法检测,且GC法前处理操作简便,分析速度快、灵敏度高[23-24],满足市场上农药残留的监督检测。啤酒中无机化合物成分较为单一,有机磷化合物在弱酸性环境中稳定性良好[25-27],因此本方法用酸化乙腈提取啤酒中的有机磷化合物,过针孔滤膜后GC法测定,以期探索一种前处理操作简单、试剂消耗量少、回收率好的检测方法,应用于市场上不同品类啤酒中有机磷农药残留的检测。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

16种有机磷农药标准品:敌敌畏、灭线磷、甲拌磷、特丁硫磷、二嗪磷、乐果、甲基毒死蜱、甲基对硫磷、毒死蜱、对硫磷、水胺硫磷、甲基异柳磷、丙溴磷、甲基硫环磷、硫环磷、三唑磷 纯度均≥96%,天津阿尔塔科技有限公司;乙腈、乙酸乙酯 色谱纯,北京百灵威科技有限公司;冰乙酸 色谱纯,国药集团化学试剂有限公司;丙酮 色谱纯,西陇科学股份有限公司;二氯甲烷 色谱纯,山东禹王实业有限公司化工分公司;氯化钠、无水硫酸钠 分析纯,天津市大茂化学试剂厂;啤酒试样 购自当地市场。

7890B气相色谱仪,配FPD检测器 安捷伦科技有限公司;WondaCAP 17色谱柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm) 日本岛津技迩(上海)商贸有限公司;YP402N电子天平 上海精密科学仪器有限公司;CF16RXⅡ低温冷冻高速离心机 上海安亭科学仪器厂;VG3S25涡旋振荡器 北京东方开物科学器材有限公司;SB25-12D超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司;KYC-100B空气恒温摇床 上海新苗医疗器械制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 前处理方法 取出冷藏保存的啤酒试样,倒适量于大烧杯中,放至于500 W的超声波仪超声10 min,以除去二氧化碳。量筒量取5 mL试样于50 mL聚丙烯刻度离心管中,准确加入10 mL 1%酸化乙腈(V冰乙酸∶V乙腈=1∶99),超声提取10 min,期间在超声波清洗机中放入冰袋,控制水温不高于40 ℃,为使农药提取更完全,360 r/min摇床再提取20 min;加入4 g氯化钠,涡旋0.5 min,3000 r/min离心30 s;取上层有机相通过填有1 cm高的无水硫酸钠注射筒和0.22 μm有机尼龙针式滤器至进样瓶,待GC分析。

1.2.2 标准工作液的配制 准确吸取一定体积的16种有机磷农药标准品,用1%酸化乙腈稀释于10 mL容量瓶中,各个农药标准储备液浓度为1.00 mg/L,于-4 ℃冰箱中储存,用1.2.1方法处理的阴性啤酒样液配制标准工作溶液,浓度依次为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15 mg/L。

1.2.3 色谱条件 色谱柱:WondaCAP 17(30 m×0.32 mm×0.25 μm);程序升温条件:100 ℃保持2 min,25 ℃/min升至150 ℃,8 ℃/min升至240 ℃,保持5 min;载气:N2(纯度99.999%),流量:3.5 mL/min(恒流模式);燃气:H2(纯度99.999%);进样口温度:220 ℃;进样方式:不分流进样,进样量:1 μL;检测器温度:250 ℃。

1.2.4 准确度与精密度 在阴性啤酒试样中加三个不同浓度水平的16种有机磷混标,每个浓度水平做三个平行,用1.2.1处理加标试样后上机测试,计算其平均回收率和RSD。

1.3 数据处理

用Execl计算测试数据平均回收率和RSD,用GraphPad Prism 5软件生成测试数据的平面柱形图和标准偏差(Standard Deviation,SD)。

2 结果与分析

2.1 啤酒基质中16种有机磷农药残留混标色谱谱图

用1.2.2处理的阴性啤酒样液按1.2.3配制标准工作溶液,在1.2.4气相色谱条件下上机测试,得到16种有机磷农药混标色谱谱图,如图1所示。

图1 啤酒基质中16种有机磷农药残留混标气相色谱谱图Fig.1 Mixed standard gas chromatogram of16 kinds of OPs pesticide residues in beer注:1:敌敌畏；2:灭线磷;3:甲拌磷;4:特丁硫磷;5:二嗪磷;6:乐果;7:甲基毒死蜱;8:甲基对硫磷;9:毒死蜱;10:对硫磷;11:水胺硫磷;12:甲基异柳磷;13:丙溴磷;14:甲基硫环磷;15:硫环磷;16:三唑磷。

2.2 试样前处理优化

2.2.1 提取试剂的选择 按1.2.1,在阴性啤酒试样中外部加标,使得上机样液浓度为0.03 mg/L,考察丙酮、乙腈、乙酸乙酯和二氯甲烷四者的提取效果。如图2所示,不同有机磷化合物在气相色谱FPD检测器峰面积大小可知,乙腈作为提取试剂,16种有机磷农药在气相色谱仪器上响应最好。丙酮作为提取溶剂,有机磷农药整体响应没有乙腈好,而且丙酮提取基质中的糖类和色素比较多,容易堵塞进样口;乙酸乙酯作为提取溶剂,提取的脂溶性杂质比较多,进样后对色谱柱损耗较大;二氯甲烷是非水溶性的,提取效果不是很理想;相比前三者,乙腈作为提取溶剂避免了提取到过多的糖类、色素和脂溶性化合物,且水溶性良好,更适用于啤酒中有机磷农药的提取。

图2 啤酒中16种有机磷农药分别经乙腈、丙酮、乙酸乙酯和二氯甲烷提取上机检测响应值Fig.2 The response values of 16 kinds of OPs pesticides in beer were extracted by acetonitrile,acetone,ethyl acetate and dichloromethane

2.2.2 乙腈的酸化 按1.2.1处理方法,在阴性啤酒试样中外部加标,使得上机样液浓度为0.03 mg/L,考察不同酸化程度的乙腈对有机磷化合物的提取效果。相较于中性环境,在弱酸性介质中,有机磷化合物的降解速率更慢、稳定性更好;如果酸性太强,化合物在分离检测过程中,其无机酸不易气化,易附着于气相色谱仪进样口和色谱柱固定相上,对其有不同程度的损坏并减短使用寿命,尤其是色谱柱。由图3知,随着乙酸量的增加,有机磷回收率增加,但是乙酸量超过1.0%后,回收率不但无明显增加,反而有些有机磷的回收率下降了,因此选择乙酸量为1.0%的乙腈作为啤酒中有机磷农残提取溶剂,并且经过多次进样未发现对进样口和色谱柱有损坏。

图3 不同酸化程度的乙腈提取啤酒中16种有机磷农药回收率Fig.3 The recovery rate of 16 kinds of OPs pesticides from beer by acetonitrile extraction with different acidification degrees

2.2.3 酸化乙腈加入量的选择 按1.2.1方法,在阴性啤酒试样中外部加标,使得上机样液浓度为0.03 mg/L,考察1%酸化乙腈不同加入量的提取效果。分别用5、8、10、15、20 mL的酸化乙腈进行提取,由图4知,加入10 mL酸化乙腈提取时,16种有机磷回收率72.33%～108.67%,可适用于啤酒样品中有机磷的检测;用5和8 mL酸化乙腈提取有机磷农药时,乐果、丙溴磷和甲基硫环磷的回收率低;用15和20 mL酸化乙腈提取有机磷农药时,16种有机磷农药回收率较10 mL提取没有明显提高;因此,取5 mL啤酒试样分析时,最佳条件为10 mL 1%酸化乙腈。

2.3 线性范围和检出限

按1.2.2方法配制16种有机磷农药混合标准工作液,在气相色谱仪平衡至基线稳定后,进一针溶剂空白,以检测目标物的仪器方法运行30 min,以3倍信噪比的峰面积分别带入不同化合物校正曲线,求得仪器检出限,10倍信噪比为仪器定量限;将仪器检出限和定量限按1.2.1处理过程推导出该检测方法的检出限和定量限(见表1)。

由表1可知,本检测方法16种有机磷农药化合物在啤酒中的检出限为0.0040～0.0190 mg/L,定量限为0.0132～0.0627 mg/L。

图4 不同体积的1%酸化乙腈提取啤酒中16种有机磷农药回收率Fig.4 The recovery rate of 16 kinds of extraction of OPs pesticides from beer by 1% acidified acetonitrile with different volumes

表1 16种有机磷线性方程和相关系数Table 1 16 Kinds of linear equations of OPs and coefficients

2.4 加标回收率和精密度实验

按1.2.4方法,试样加标浓度水平分别为0.03、0.05和0.08 mg/L,每个浓度水平做六个平行样,用1.2.1处理后上机测试,结果见表2。

表2 16种有机磷回收率和RSD Table 2 Recovery rates and relative standard deviations of 16 kinds of OPs

由表2可知,啤酒中添加三个浓度水平的16种有机磷农药化合物,其回收率在72.33%～113.00%之间,RSD在0.52%～9.92%之间,依据GB/T 27404-2008附录F,其回收率和RSD均符合要求,能够满足啤酒中以上16种有机磷农药残留的检测。

2.5 实际样品检测

在市场上随机购买十种不同种类的啤酒,按1.2.1处理后上气相色谱仪检测,检测结果见表3。

表3 实样测试结果Table 3 Test results of actual samples

通过查阅食品安全国家标准《GB 2763-2016食品中农药最大残留限量》[28]知,啤酒产品以及其以上16种有机磷农药的检测暂无检验标准;因此,本方法的建立在10种啤酒实际样品的检测中(表3),未检出以上有机磷农药。

3 结论

在5 mL阴性啤酒中外部加标,用10 mL 1%酸化乙腈提取后上机检测,通过分析知该检测方法操作过程简单、试剂使用量小,线性范围0.01～10.0 mg/L,检出限0.0040～0.0190 mg/L,定量限0.0132～0.0627 mg/L,检测范围能够满足啤酒中以上16中有机磷农残的检测;方法回收率较高,在72.33～113.00%,RSD在0.52～9.92%,检测数据稳定性好;实际样品检测结果均为未检出;因此,该检测方法适合于市售啤酒中以上16种有机磷农药残留的检测。