自噬在硼替佐米诱导的肾癌细胞凋亡中作用的研究

陈福东，肖 帅，张鸿雁，毕林涛

(吉林大学中日联谊医院 1.手术室；2.核医学科；3.肿瘤血液科，吉林 长春130033)

据统计资料显示，我国肾癌发病率呈逐年上升趋势，至2008年已跃居我国男性恶性肿瘤发病率第10位[1]。肾癌的传统治疗方法效果并不理想。有文献表明[2]，基于肾细胞癌的分子水平的治疗策略显示出潜在的优势。近来的研究表明，自噬在抗肿瘤药物引起的细胞凋亡中发挥重要的作用[3]。本研究利用体外培养人肾癌ACHN细胞，探讨自噬在硼替佐米诱导的肾癌细胞凋亡中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

人肾癌ACHN细胞系购于中国科学院上海生命科学研究院；G250考马斯亮蓝、十二烷基硫酸钠(SDS)、三羟甲基胺基甲烷(Tris-Base)与四甲基二乙胺(TEMED)购于美国Sigma公司；HEPES缓冲液、L-谷氨酰胺购于美国Amresco公司；标准胎牛血清(FBS)购于江苏晶美生物科技有限公司；Caspase-3、LC3购于Santa Cruz公司；胰蛋白酶、辣根过氧化物酶羊抗鼠二抗购于北京鼎国生物技术有限公司；噻唑蓝(MTT)购于北京赛驰生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1药物、试剂配置 配置1640完全培养液、D-Hanks液、PBS液、0.25%胰蛋白酶溶液、电泳缓冲液、电泳转移缓冲液、12%分离胶、浓缩胶。

1.2.2细胞培养 a)细胞复苏;b)细胞培养及传代;c)细胞冻存。

1.2.3MTT检测细胞增殖率 酶联免疫检测仪，波长490 nm检测，增殖率=(1-实验组/对照组)×100%。

1.2.4Western blotting 检测硼替佐米对人肾癌ACHN细胞凋亡相关蛋白cleaved caspase-3及自噬相关蛋白LC3表达水平的影响

1.3 统计学处理

所有数据采用SPSS 16.0软件进行统计学处理，各个样本均数间的统计学差异采用t检验进行分析，采用方差分析比较不同组间的均数差异，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 硼替佐米对ACHN细胞增殖抑制率影响

分别应用0 nM、5 nM、10 nM、20 nM、30 nM、50 nM硼替佐米处理ACHN细胞24 h后，MTT检测结果(图 1)表明，硼替佐米呈剂量依赖性地抑制细胞增殖。后续实验选用20 nM浓度进行单独以及联合用药。

图1 硼替佐米对ACHN细胞24 小时抑制率

2.2 硼替佐米对ACHN细胞凋亡相关蛋白cleaved caspase-3表达水平的影响

分别应用10 nM、20 nM、30 nM 硼替佐米处理ACHN细胞24h，Western Blotting检测凋亡相关蛋白cleaved caspase-3表达水平(图2 )。与对照组相比，硼替佐米可以明显地增加ACHN细胞凋亡。

图2 硼替佐米对caspase-3蛋白的影响

2.3 硼替佐米对ACHN细胞自噬相关蛋LC3表达水平的影响

分别应用10 nM、20 nM、30 nM 硼替佐米处理ACHN细胞24 h，Western Blotting检测自噬相关蛋白LC3表达水平(图 3)，硼替佐米明显增加了ACHN细胞的自噬。

图3 硼替佐米对ACHN细胞LC3蛋白的影响

2.4 自噬抑制剂3-MA联合硼替佐米对ACHN细胞增殖及对凋亡相关蛋白cleaved caspase 3 的表达水平的影响

联用3-MA可以进一步抑制ACHN细胞增殖(图4)，促进ACHN细胞凋亡(图5)。

3 讨论

硼替佐米为硼酸肽类化合物,它可选择性作用到26S蛋白酶体,通过可逆性地抑制蛋白酶体活性而抑制多种蛋白的降解过程,从而影响多种细胞功能，如细胞周期,诱导细胞凋亡等，表现出了良好的抗肿瘤活性。大多数的抗癌药都能引起其敏感细胞发生凋亡，而凋亡过程的发生需要Caspases的参与。Caspases家族是细胞凋亡过程中的效应蛋白，通过蛋白酶水解，活化的Caspases可以进行细胞内信号转导[4]。而本实验中检测的Caspase-3则是这个家族中最重要的死亡执行者，它广泛分布在各类细胞中，主要以无活性的酶原形式存在，而活化的Caspase-3则能够促进凋亡信号的转导。在本实验中，硼替佐米明显增强了Caspase-3在肾癌细胞中的表达，促进肾癌细胞发生凋亡。

自噬是细胞通过各种途径在自噬溶酶体内进行自我消化，分解细胞内受损的细胞器、蛋白质等。基础水平的自噬帮助细胞维持稳态，实现自我更新等。当受到较严重损伤无法自我修复，细胞就会发生自噬性死亡[5]。细胞自噬过程分四个阶段：启动、延长、成熟和降解。自噬相关蛋白Beclin1在启动阶段发挥重要作用，LC3主要在延长阶段发挥作用。在自噬过程中，定位于细胞质中的P62与经泛素化的蛋白结合，P62蛋白再与LC3-II形成复合物，在溶酶体内被降解，以至于P62蛋白在细胞自噬过程中不断被消耗[6,7]。本实验结果显示，硼替佐米促进肾癌细胞的自噬，明显降低了P62的表达水平。

图4 3-MA联合硼替佐米对ACHN细胞增殖影响

图5 3-MA联合硼替佐米对ACHN细胞凋亡的影响

据报道，许多抗癌剂诱导自噬[8-10]，导致自噬细胞死亡可能是这些药物杀死肿瘤细胞的重要机制；然而，最新文献显示雷帕霉素诱导的自噬可以保护各种肿瘤细胞系对一般凋亡刺激诱导的凋亡。自噬是否真的是一个重要的细胞死亡机制仍有高度争议，因为它也有可能是细胞试图生存的机制。对于自噬与凋亡的交互作用，可以分三类即合作关系、对抗关系与推动关系[11]。合作关系即自噬和凋亡协同作用，或通过互补机制共同导致细胞死亡；对抗关系即自噬与凋亡在引起细胞的过程中起着截然相反的作用，自噬不但不引起细胞死亡，反而在凋亡过程中维持癌症细胞存活；推动关系中自噬虽然也是程序性细胞死亡，但并没有直接参与细胞死亡，而是为细胞凋亡提供营养支持。例如细胞遭受营养剥夺时，自噬水平的上调可以维持胞内ATP水平，使得内磷脂酰丝氨酸得以向胞外暴露释放出凋亡信号，如果自噬受到抑制，这类ATP依赖性特征性凋亡发生也会减少，但对其它凋亡反应并无影响[12]。本研究结果表明抑制自噬可以增强硼替佐米诱导的ACHN细胞凋亡作用，这提示自噬可能在ACHN细胞凋亡过程中发挥促进其存活的作用，抑制自噬增强了硼替佐米抗肿瘤作用。