我院136株流感嗜血杆菌分离特点及耐药性分析

王玉洁,国 霞,王晓飞

(青岛市市立医院 1.检验科； 2.肿瘤科， 山东 青岛266001)

流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza,Hi)是一种短小的革兰阴性杆菌，分布在咽部、鼻部及鼻咽部，是条件致病菌，也是引起社区性肺炎的主要致病菌。在住院患者免疫力较低情况下容易引起肺炎及气管炎，也可合并支气管扩张、COPD感染。国内有学者研究显示，当患者年龄在60岁以上，Hi感染并合并其他多种严重基础疾病，有引起死亡可能[1]，与国外报道一致[2]。Hi是一种苛养菌，生长需要v因子与x因子，菌落生长缓慢、细小，与副流感杆菌混淆，容易被忽视掉，是一种需要重点关注的条件致病菌。

1 材料与方法

1.1 菌株来源回顾性整理我院2015年12月至2018年11月间分离出的Hi136株，标本来源为痰标本133例、伤口分泌物1例、胸腹水2例。

1.2 标本采集清洗口腔后咳出深部痰标本或抽取痰，无菌痰杯盛取。抽取无菌体液及脓液标本，无菌管盛取，2 h内送检。

1.3 试剂5%绵羊血培养基、麦康凯培养基、巧克力培养基、HTM培养基、质谱仪、头孢硝噻吩试纸片为法国梅里埃公司产品；药敏标准纸片为英国Oxoid公司产品；金黄色葡萄球菌标准菌株为ATCC25923，Hi标准菌株为ATCC49247，由山东临检中心购置。

1.4 方法

1.4.1细菌鉴定 痰标本涂片符合规范要求，上皮细胞≤10个/低倍镜，白细胞≥25个/低倍镜。标本于2 h内接种血平板、麦康凯和巧克力平板， 35℃±1℃，5%-10%CO2孵箱培养18-48 h。挑取圆形、湿润、透明小菌落，金葡标准菌株ATCC25923卫星试验阳性，经MS鉴定确认为Hi。

1.4.2分组 按照季节性分离情况分为春夏秋冬4组，春季3月1日至5月31日，夏季6月1日至8月31日，秋季9月1日至11月30日，冬季12月1日至2月28日。 按科室分离情况选取前六位，分别为呼吸科、重症监护科、心血管、肾脏科、烧伤科、及内分泌科。

1.4.3生物学分型 根据对吲哚、脲酶、鸟氨酸脱羧酶3种生化反应结果对比，对分离Hi进行生物学分型。共分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅵ型、Ⅶ型、Ⅴ-Ⅷ型8个生物型。

1.4.4药敏 头孢硝噻吩试纸片法沾取菌落检测β-内酰胺酶，红色为阳性，不变色为阴性，对照质控菌株ATCC49247。药敏试验纸片分别有氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、阿奇霉素、四环素、氯霉素、头孢呋辛、环丙沙星、头孢他啶、头孢噻肟、复方磺胺。标准K-B法，HTM培养基，准确量取直径。结果判定参照CLSIM100标准，分敏感、中介、耐药3种结果。

1.4.5统计学分析 实验室数据使用WHONET5.6软件统计分析。

2 结果

2.1 按季节分离分组比较冬季61株(44.9%)，春季44株(32.4%)，秋季22株(16.2%)，夏季9株(6.7%)，冬季、春季明显增多。

2.2 按科室分离分组比较分离排名前6位科室菌株及占比：呼吸科61株(44.9%)，心脏内科31株(22.8%)，ICU15株(11.0%)，肾脏科11株(8.1%)，烧伤科11株(8.1%)，内分泌科7株(44.9%)，以呼吸科最多，且多数患者伴随基础疾病。

2.3 β-内酰胺酶检测结果经头孢硝噻吩试验，β-内酰胺酶阳性菌株55株(40.4%)，其中49株氨苄西林耐药，6株氨苄西林中介。β-内酰胺酶阴性菌株81株(59.6%)，其中氨苄西林耐药3株，中介2株。

2.4 生物学分型情况根据对吲哚、脲酶、鸟氨酸脱羧酶3种生化反应结果对136株Hi进行生物学分型，Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型最多，Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ型未发现。产酶率Ⅰ型最低(10%)，见表1。

表1 136株Hi生物学分型结果及产酶率(%)

2.5 临床常用抗生素的药敏结果氨苄西林耐药率38.2%，复方新诺明耐药率65.38%。阿奇霉素、氯霉素、四环素、氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸的敏感率均大于80%，头孢呋辛、头孢噻肟的敏感率均>90%，分离2株环丙沙星耐药株，敏感率98.5%，见表2。

表2 136株Hi对10种抗菌药物的药敏结果(%)

3 结论

Hi是一种革兰阴性小杆菌，菌落细小，无色透明，生长缓慢，临床经验不足的初学者往往忽略其生长，容易漏检，造成临床分离率低。Hi营养要求高，分离需要v因子、X因子。加万古霉素的巧克力培养基，不仅含有X因子，v因子在加热过程中也被释放出来，在培养基中加入万古霉素，还可有效的抑制其他革兰阳性球菌生长，提高分离率，必要时培养应延长至48 h。挑选可疑菌落时，应注意与副流感嗜血杆菌、溶血嗜血杆菌与副溶血嗜血杆菌相鉴别。本研究标本全部来自我院住院患者，标本采集按照第4版《全国临床检验操作规程》微生物标本采集要求执行。本实验室对疑似Hi菌株首先用金匍标准菌株ATCC25923做卫星试验(同时用血平板、MH平板做副流感鉴别)。挑选卫星试验阳性菌落再进行质谱鉴定确认，最终鉴定为Hi。

本研究通过春夏秋冬4个季节对Hi菌株分布做统计分析，冬季分离菌株61株， (44.9%)，春季44株(32.4%)，以冬、春最多，有明显的季节性。在患者科室统计中，呼吸科病人最多61例(44.9%)，心内科31例(22.8%)次之。病种统计多为肺炎、支气管炎、支扩及COPD感染。有研究显示[1]，Hi是造成CAP和HAP主要病原菌，这些病人以老年人及重症病人居多，多卧床不能自理，免疫力低，感染机会增加，且合并多种基础疾病，严重者可引起死亡，与本文的研究一致(本院儿科住院患者痰标本送检少，获得数据也较少，3年仅2例)。

根据对吲哚、脲酶、鸟氨酸脱羧酶3种生化反应结果Hi可分为Ⅰ-Ⅷ八个生物型，文献报道，生物Ⅰ型与儿童脑膜炎有关，生物Ⅱ型、Ⅲ型主要引起肺炎和上呼道感染[3]。有研究认为Hi在不同地区生物学分型，存在区域性差异[4]，即使在同一地区，不同医院或年龄不同，Hi生物学分型也存在差异性[1]。也有研究证明，生物学分型与感染的不同类型、抗原性质、抗生素耐药类型有关[5]，有地域差别。本研究Hi生物分型主要以Ⅱ型(36.0%)、Ⅲ型(31.6%)、Ⅳ型(23.5%)为主，Ⅰ型(7.4%)、Ⅶ型(1.5%)较少，Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ型未发现，与陈碧英等[6]研究不一致。而杨旭等[7]认为Hi生物分型以Ⅳ型为主(69.5%)，与本研究不一致。本研究Hi产酶菌株55株，产酶率分别为Ⅰ型10%、Ⅱ型57.1%、Ⅲ型51.2%、Ⅳ型12.5%，总产酶率40.4%。有学者认为Hi产酶率成人和儿童有较大不同，儿童高于成人，差异有显著性[8]。

一直以来氨苄西林是Hi感染的首选抗生素，随着抗菌药物的不规范使用，耐药菌株出现，使氨苄西林耐药性逐年升高，本研究统计本院氨苄西林的耐药率为38.2%，和欧洲的耐药率16.8%[9]比较有差别，也有文献报道某地区儿童医院氨苄西林耐药K-B法达49.07%，MIC法达到了82.2%[10]。本研究β-内酰胺酶阴性氨苄西林耐药(β-lactamase negative ampicillin resistant,BLNAR)3株，β-内酰胺酶阴性氨苄西林中介(β-lactamase negative ampicillin intermediates,BLNAT)2株，其耐药机制是可能是由于菌株细胞壁上一种或多种青霉素结合蛋白发生改变，引起青霉素结合蛋白与靶位亲和力降低，还可能与外膜结合蛋白改变导致耐药有关[8]，应当引起重视。本研究Hi对复方磺胺表现较高耐药性，达到65.38%，对阿奇霉素、氯霉素、四环素、氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸、头孢呋辛、头孢噻肟、环丙沙星的敏感率达80%-90%。不管是β-内酰胺酶阳性或β-内酰胺酶阴性菌株，对三代头孢都有较好的敏感性[11]，这和国外研究证明一致。Hi对氨苄西林的耐药机制是菌株产生质粒介导的β-内酰胺酶，主要是TEM-I型酶，其次是ROB-1型酶[12]。国内学者研究报道，β-内酰胺酶检出基因均为TEM-I型,未见ROB-1型[13,14]。国外学者研究显示，β-内酰胺酶TEM-I型酶占93.7%，ROB-1型酶占4.6%[12]，几乎所有产ROB-1型酶菌株均出现在北美[15]。

综上所述，通过本院病例分析，Hi分离有季节性差别，以春、冬两季为主，感染者以呼吸科患者为主，其他患有基础疾病的患者感染机会较多。Hi生物分型主要以Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型为主。氨苄青霉素和复方磺胺已不再作为感染的Hi首选药物，三代头孢、红霉素、四环素、环丙沙星敏感率高。其中β-内酰胺酶阴性，氨苄西林耐药或中介(BLNAR或BLNAT)菌株因为细胞壁的改变导致对药物的亲和力降低引起耐药应当引起重视。