血清miRNA-195作为帕金森病潜在生物学标记物的初步研究

陈子旋?朱丽娜?刘雯?解孝艳　杨厉颖　周静雯　徐将　刘姜冰　王英歌　唐向明

【摘要】背景近年来有研究表明血清微小RNA（microRNA，miRNA）可作为疾病生物学标志物，有助于疾病的发病风险评估、早期诊断以及监测治疗效果和预后。本研究对一种血清miRNA与帕金森病（PD）相关性进行探究，力求寻找PD早期诊断可能的生物学标志物。 目的 研究末梢血清miRNA作为帕金森病生物标志物的潜力。 方法 采集36例PD患者和36例健康体检者血清标本，通过RT-qPCR检测血清内miR-195的表达。收集211例PD患者和113例健康人临床资料进行统计分析。结果与健康体检者相比，PD患者血清miR-195表达水平明显上调。临床统计资料分析显示吸烟、糖尿病与PD发病呈负相关，高血压可能与PD发病呈正相关，PD病人伴有外周血红细胞及血红蛋白量降低。

【关键词】帕金森病（PD）;血清;miRNA;生物标记物;危险因素

【中图分类号】R37 【文献标识码】A 【文章编号】ISSN.2095.6681.2020.18..02

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是一种常见于中老年人的神经系统退行性病变，以脑内黑质多巴胺能神经元进行性缺失为病理特征。PD临床运动症状有静止性震颤、运动迟缓、肌强直以及姿势步态障碍等，非运动症状包括认知障碍、嗅觉丧失、便秘等。多数患者的非运动症状较运动症状出现早，PD的诊断主要依赖于临床运动症状。影像学早期无典型特征[1]，缺乏特异性生物学标志物，导致PD早期诊断困难。所以寻找特异性较高的生物学标记物是PD早期诊断的重要问题。为寻找PD早期诊断的生物学标记物，大量学者对脑脊液，血浆，血清，唾液，尿液，皮肤等组织标本进行基因测序，发现血清中循环RNA作为生物学标记物具有优势。尽管大量研究对PD患者血清中miRNA进行探索，结果却存在异质性。Aghili[2]制作出miR-195电化学纳米生物传感器用于早期诊断PD，其敏感性和特异性需进一步证实。本研究旨在探索外周循环血清miR-195与PD发病的相关性，为PD的早期识别提供实验依据。

1 材料与方法

本实验自2018年5月～2019年10月收集扬州大学附属医院72个汉族个体血液，所有受试者均已签署知情同意书。帕金森病的诊断依据典型临床症状和体征以及影像学确诊，主要排除标准包括PD病人合并肿瘤、恶液质、全身或中枢神经系统严重感染;伴有心、肝、肾或其他脏器严重疾病的病史。另收集211个帕金森患者和113个正常体检者的临床资料进行分析。这项研究得到了扬州大学附属医院伦理委员会的批准。

采集空腹安静状态下PD病人和健康者血液，离心取上清液至-80°C贮存。使用miRNA提取分离试剂盒（北京天根）提取小分子RNA。血清中提取出的RNA使用miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂进行逆转录。反应液可于-20°C保存。进行下游荧光定量检测前，将cDNA反应液加入4倍DEPC水稀释使用。使用miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒（北京天根）、SYBR、miR-195引物和内参U6，配置20ul体系试剂，使用荧光定量聚合酶链反应仪（罗氏LightCycler480）检测。样本一式两份进行，最终miRNA表达量计算为2-ΔΔCt。

2 统计分析

使用统计产品SPSS16.0版进行统计分析，实验中miR-195表达量通过独立t检验，临床数据通过x2检验和独立t检验进行分析。

3 结 果

实验测量和分析了miRNA-195（CT值，7.296±1.42774）的相對表达量。统计学分析发现PD病人血清中miRNA-195（P=0.001）表达量明显高于健康人，结果具有统计学意义。临床收集的211例PD患者中，男性121例，女性90例，年龄处于72.76±8.47岁。临床数据结果由表可知高血压可促进PD进展，糖尿病、吸烟不增加PD的发病风险。PD患者较健康人群外周血红细胞和血红蛋白含量降低。见下表

4 讨 论

目前大部分神经系统疾病的诊断主要依靠临床症状和影像学检查，这使得该类疾病的早期防治策略的开发受到限制。目前已发现多种血清miRNAs可作为PD诊断的生物学标记物。Barbagallo等人[3]对139例神经退行性疾病患者和健康人血清中23种miRNAs检测发现，部分miRNAs的分泌具有特异性，从而可用于神经退行性疾病的无创诊断。本研究测得miR-195在PD患者血清表达上调，与马文斌[4]，曹向阳[5]研究结果一致。Aghili等人[2]制作出miR-195电化学纳米生物传感器用于早期诊断PD，本实验进一步证明其可行性。本研究具有一定的局限性，收集血清样本均来自汉族72位个体，是否适用于其他种族仍需进一步探究，且样本量有待进一步扩大。

本研究发现糖尿病、吸烟与PD发病呈负相关，这与夏虹等人[6]使用meta分析结果一致。脑内胰岛素调节受损与多巴胺转运体基因表达改变具有相关性[7]，这为糖尿病在PD中的不同作用提供了依据。高血压与PD的发生发展密不可分。实验室结果证明PD患者血中红细胞和血红蛋白数量减低。目前有研究提示铁代谢紊乱造成的贫血可作为促进PD病理进展的危险因素，而外周血中高氧化应激状态和红细胞内α-突触核蛋白的聚集可能加重对外周血红细胞的破坏作用[8]。

miRNA作为PD早期识别生物学标志物的临床意义包括阻碍和延缓症状的发生，前移PD康复治疗的时间窗，帮助病人做到提前干预，在指导康复治疗中起到辅助作用。尽管血清中的一些microRNAs可以作为潜在的帕金森病生物学标记物，但距离应用于临床诊断仍有很大距离。目前临床对早期帕金森病的误诊率高达25%，多在神经元损伤后5～15年内方可确诊，临床更多目光聚焦于帕金森病的康复治疗。目前康复治疗方法多种多样，但均需要针对个别患者特征制定不同的康复计划。运动影像和动作观察疗法、虚拟现实、耐力运动训练、力量训练，有氧训练和物理疗法被认为是有前途的PD康复方法。另外，负责神经功能障碍康复的Lokomat机器人常应用于帕金森疾病康复治疗，使患者运动能力得到改善[9][10][11]。随着科技和医疗的发展，PD的康复治疗将会有更多的进展，这也将为PD患者带来更多有效的治疗方案。

5 结 论

血清miRNA-195可能作为帕金森病诊断的生物学标记物，目前需要更多的研究来证实。吸烟、糖尿病与PD发病呈负相关，高血压、贫血是PD发生的危险因素。帕金森病无法达到治愈目的，临床注重PD患者的康复治疗。

参考文献

[1] 贺志明，黄月明.帕金森病的诊断和治疗进展[J].邵阳学院学报（自然科学版），2019，16（06）：90-94.

[2] Aghili Z，Nasirizadeh N， Divsalar A，et al. A highly sensitive miR-195 nanobiosensor for early detection of Parkinson's disease. Artif Cells Nanomed Biotechnol.2018;46（sup1）：32‐40.

[3] Barbagallo C， Mostile G， Baglieri G， et al. Specific Signatures of Serum miRNAs as Potential Biomarkers to Discriminate Clinically Similar Neurodegenerative and Vascular-Related Diseases. Cell Mol Neurobiol. 2020;40（4）：531‐546.

[4] Ma W， Li Y， Wang C， Xu F， et al. Serum miR-221 serves as a biomarker for Parkinson's disease. Cell Biochem Funct. 2016;34（7）：511‐515.

[5] Cao XY，Lu JM，Zhao ZQ，et al.MicroRNA biomarkers of Parkinson's disease in serum exosome-like microvesicles.Neurosci Lett. 2017;644：94‐99.

[6] 夏 虹，葉 民，毕早安，饶峰.糖尿病与帕金森病发病风险的Meta分析[J].重庆医科大学学报，2019，44（04）：487-492.

[7] Cardoso S， Correia S， Santos RX， et al. Insulin is a two-edged knife on the brain. J Alzheimers Dis. 2009;18（3）：483‐507.

[8] 邓庆远.原发性帕金森病患者血红蛋白水平和血清铁代谢的研究[D].南方医科大学，2017.

[9] 吴雪娇，周 哲，沈夏锋等.行为观察疗法用于帕金森病康复治疗的研究进展[J].上海医药，2019，40（19）：3-7+70.

[10] 冯 浩，李翠云，刘镓雨，等.虚拟现实训练对帕金森病患者步行能力的影响[J].中国卫生标准管理，2019，10（12）：32-34.

[11] 夏 敏，詹增土，蔡国恩等.帕金森病患者全自动下肢机器人训练前后的三维步态分析[J].中华神经科杂志，2018，51（07）：504-509.