橙皮素对高脂血症仓鼠的降脂作用和肝脂肪变性的影响*

覃瑛，许键炜，李晓杰，周谊霞**，李委

(1.贵州医科大学 护理学院，贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学 基础医学院，贵州 贵阳 550004； 3.毕节医学高等专科学校 护理系，贵州 毕节 551700)

高脂血症临床上称之为血脂异常(dyslipidemia)，是众多心脑血管疾病、非酒精性脂肪肝、代谢性综合征等慢性疾病的重要危险因素。2018年我国疾病控制与预防中心的调查数据显示，我国成人血脂异常总患病率高达49.20%，远高于2002年的水平，且发病年龄逐渐趋于年轻化[1]，有效管理血脂已成为医疗保健工作中的重点内容。肝脏是机体进行物质代谢的重要器官，高脂血症可引起脂肪在肝脏中的堆积，使肝细胞发生脂肪变性、肝功能下降，严重者发展成脂肪肝，进一步加重脂质代谢紊乱[2]。因此，开发疗效好又无明显肝毒性的降脂天然活性物质逐渐成为近年来的研究热点。橙皮素(hesperetin，HES)是广泛存在于芸香科柑橘属植物果实中的一种天然黄酮类物质，研究表明HES具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性[3-4]，还有研究报道HES能降低动物模型中的血脂水平[5-6]，但HES对高脂饮食诱导的肝脂肪变性的影响目前国内外还鲜见报道。仓鼠，又称叙利亚金黄地鼠，与常用的大小鼠相比，仓鼠的脂代谢特征与人类更为接近，是研究脂代谢紊乱性疾病的优势动物模型[7]。本研究通过高脂饮食喂养建立拟人化仓鼠高脂血症模型，探讨HES对血脂的调节作用以及对肝脂肪变性的影响，拟为拓宽对HES健康效益的认识和合理利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1主要试剂和仪器 HES，黄色粉末，纯度为97%，上海麦克林生化科技有限公司(批号C10358475)；羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethyl cellulose，CMCNa)，北京索莱宝生物科技有限公司(批号C8620)；总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)测定试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司(批号分别为182041、197971、191321、191271)；总抗氧化能力(total antioxidant capacity，TAC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷丙转氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)测定试剂盒，苏州格锐思生物科技有限公司(批号分别为G0115W、G0101W、G0109W、G0423W、G0424W)；总RNA提取试剂、反转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)试剂盒，北京康润诚业生物科技有限公司(批号分别为P118-05、A224-05、A305-05)。冷冻离心机，美国Thermo Fisher公司(型号Heraeus Fresco 21)；多功能酶标仪，美国Bio-Tek公司(型号ELX800uv)；实时荧光定量PCR仪，美国Bio-Rad公司(型号CFX96)；石蜡切片机，上海徕卡仪器有限公司(型号：RM2016)；正置光学显微镜，日本Nikon公司(型号Nikon Eclipse E100)；组织研磨器，上海净信实业发展有限公司(型号MY-20)。

1.1.2实验动物 SPF级仓鼠由河北医科大学脂代谢研究室馈赠，生产许可证编号[SCXK(京)2012-0001]，饲养并繁殖于贵州医科大学动物实验中心[SYXK(黔)2018-0001]。实验动物供清洁自来水和标准饲料，自由进食和饮水，室内环境温度为22～24 ℃，湿度为50%～60%，12 h明暗交替循环(7 ∶00-19 ∶00)。选取18只8周龄雄性仓鼠为研究对象，体质量105.78～125.32 g。本研究方案已通过贵州医科大学实验动物伦理委员会审核并批准(伦理审查编号1800812)。本实验严格遵守动物伦理学3R原则。

1.2 方法

1.2.1动物造模和分组 按照简单随机分组法，运用SPSSS 25.0软件生成随机数字，将18只8周龄雄性仓鼠随机分为空白对照组(NC组)、高脂血症模型组(Model组)、HES组。NC组仓鼠喂饲普通饲料，另2组喂饲高脂饲料，高脂饲料配方为1.25%胆固醇+20%猪油+78.75%基础饲料。HES组仓鼠按100 mg/kg的剂量予HES灌胃给药[8]，1次/d，连续干预6周。NC组及Model组给予相同体积的溶媒0.5% CMCNa灌胃处理。

1.2.2动物处理及标本收集 实验期间将动物按组分笼饲养，每日观察动物的精神状态、活动情况、饮水饮食变化及毛发体态变化等行为学情况，每周一清晨定时称取体质量。分别于实验开始时、实验第3周和实验末(实验第6周末)仓鼠禁食不禁水12 h，行内眦静脉丛采血，4 000 r/min，4 ℃离心10 min，离心2次，分离上层血清。第6周末取血后，麻醉后处死仓鼠，行心脏灌流，取出肝脏，用滤纸吸干多余水分后迅速称取质量。将肝脏分为2部分，一部分剪成约100 mg的小块投入液氮速冻后-80 ℃保存，一部分置于4%多聚甲醛中固定保存，用于病理形态学检测。

1.2.3肝脏指数的测定 分离仓鼠的肝脏后称取质量，按公式计算肝脏指数：肝脏指数=肝脏质量/体质量×100%。

1.2.4血脂和肝脏脂质含量的测定 血清TC、TG、LDL-C、HDL-C按相应的试剂盒说明书进行检测。-80 ℃取出肝脏组织块，称质量后迅速置入装有预冷的PBS 1 mL的EP管中，用组织研磨器充分匀浆制备成肝匀浆液，采用改良的Blign & Dyer法[9]抽提出肝脏中的脂质，用TC、TG测定试剂盒测定样品中TC、TG含量，校正称取的肝脏质量，即得到肝脏组织中TC、TG的含量。

1.2.5肝脏组织TAC、SOD、MDA水平和肝功能指标的测定 肝脏中TAC、SOD、MDA的含量及肝功能指标ALT、AST按相应的试剂盒说明书进行测定。

1.2.6肝脏病理学观察 将固定好的肝脏组织行石蜡包埋，制作厚度为5 μm的石蜡切片、HE染色，显微镜下观察分析、拍照。

1.2.7肝脏组织固醇调节元件结合蛋白-2(sterol regulatory element binding protein-2，Srebp2)和3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶(3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-CoAReductase，HMGCR) mRNA表达 称取约100 mg肝脏组织，用TRIGene试剂提取总RNA，根据逆转录试剂盒说明书合成cDNA；使用SYBR green染料法进行RT-qPCR测定肝脏中Srebp2和HMGCRmRNA表达水平，反应总体系为20 μL。以GAPDH为内参基因。引物序列：Srebf2-F为GTGGTGGCAGTGGCAGTAACG，Srebf2-R为GGCTGAACGACCGCTGTATTCC；HMGCR-F为AATTGGAGTTGGCACCATGTCAGG，HMGCR-R为ACGAAGTAGTTGGCAAGCACAGAC；GAPDH-F为AAGGCACAGTCAAGGCTGAGAATG，GAPDH-R为CTCCACAACATACTCGGCACCAG。反应条件为： UNG酶50 ℃处理5 min，95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s、60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。目的基因的mRNA相对表达量用2-△△Ct法分析，△Ct值=Ct目的基因-CtGAPDH;△△Ct=△Ct实验组-△Ct对照组。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 一般情况、体质量及肝脏指数

NC组仓鼠实验期间精神佳、毛色顺滑有光泽、身体动作灵活机敏；Model组及HES组仓鼠实验前期精神活动状况良好，Model组中后期开始逐渐出现精神萎靡、毛发凌乱、食欲下降、活动迟缓且不喜活动等现象，HES组仓鼠上述情况较Model组轻。各组仓鼠基础体质量在同一水平(P>0.05)，实验期间仓鼠体质量均有所上升；与NC组比较，Model组仓鼠的最终体质量及肝脏指数升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与Model组比较，HES组仓鼠的最终体质量及肝脏指数下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组仓鼠体质量及肝脏指数变化Tab.1 Changes of weight and liver

2.2 HES对血脂水平的影响

结果显示，实验开始时，各组仓鼠的基础血脂水平接近，差异无统计学意义(P>0.05)。实验第3周和第6周时，与NC组比较，Model组仓鼠血清TC、TG、LDL-C及HDL-C水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与Model组相比，HES组仓鼠血清TC、TG、LDLC水平下降、差异有统计学意义(P<0.05)，HDL-C水平比较、差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

注：(1)与NC组比较，P<0.05；(2)与Model组比较，P<0.05。图1 橙皮素对各组仓鼠血脂水平的影响Fig.1 Effect of hesperetin on serum lipids level in each group

2.3 HES对肝脏组织TC、TG水平的影响

结果显示，实验第6周时，与NC组比较，Model组仓鼠肝脏组织TC、TG水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与Model组比较，HES组仓鼠肝脏中TC、TG水平下降差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

2.4 HES对肝脏组织抗氧化酶活力及MDA含量的影响

结果显示，实验第6周时，与NC组比较，Model组仓鼠肝脏TAC及SOD水平下降，MDA生成量升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与Model组比较，HES组仓鼠肝脏TAC及SOD水平上升，MDA含量下降(P<0.05)，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

注：(1)与NC组比较，P<0.05；(2)与Model组比较，P<0.05。图2 橙皮素对各组仓鼠肝脏中TC、TG水平的影响Fig.2 Effect of hesperetin on TC and TG levels of hamsters' livers in each group

表2 橙皮素对各组仓鼠肝脏中抗氧化酶活性及MDA生成量的影响Tab.2 Effect of hesperetin on serum antioxidant enzyme activity and MDA level in

2.5 HES对血清ALT、AST活力的影响

结果显示，实验第6周时，与NC组比较，Model组仓鼠血清中ALT、AST活力升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与Model组比较，HES组血清中ALT、AST活力下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.6 肝脏病理学检测

结果显示，实验第6周时，仓鼠肝脏标本大体观察可见，NC组肝脏呈暗红色，表面光滑，质地柔软，边缘锐利；Model组肝脏呈乳白色，体积明显增大，边缘圆钝增厚、包膜紧张，质硬易碎，有明显的油腻感；HES组肝脏颜色呈黄白色、表面散在点状褐色，油腻感较Model组轻。肝脏石蜡切片HE染色可见，NC组肝细胞大小均匀，细胞质丰富、着色均匀，细胞核圆而居中，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状分布，表现出完整而清晰的肝小叶结构；Model组肝细胞体积明显增大且大小不一，细胞质内出现大小不等的圆形空泡甚至融合成片，细胞核固缩深染、受到挤压而变形甚至消失，肝索排列紊乱，表现出典型的脂肪肝病变；与Model相比，HES组肝脏脂肪变性程度有所改善，肝细胞体积肿胀减轻，脂质空泡数量减少，可见较为明显的肝小叶结构。见图3。

表3 橙皮素对实验仓鼠血清中AST、ALT活力的影响Tab.3 Effect of hesperetin on serum AST and ALT level in each

2.7 HES对肝脏组织Srebp2和HMGCR mRNA表达水平的影响

结果显示，实验第6周时，与NC组比较，Model组仓鼠肝脏组织中Srebp2和HMGCRmRNA表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与Model组比较，HES组肝脏组织中Srebp2和HMGCRmRNA表达水平下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

图3 各组仓鼠肝组织学表现(HE)Fig.3 Histological expression of livers in each group(HE)

注：(1)与NC组比较，P<0.05；(2)与Model组比较，P<0.05。图4 橙皮素对各组鼠肝脏中Srebp2和HMGCR mRNA表达的影响Fig.4 Effect of hesperetin on hepatic Srebp2 andHMGCR mRNA expression in each group

3 讨论

HES广泛存在于柑橘属植物果实中，来源广泛、获取便利，其药用活性已吸引诸多研究者的关注。本研究通过建立拟人化高脂血症仓鼠模型探讨HES对血脂和肝脂肪变性的作用，结果表明HES能够抑制高脂饮食诱导的仓鼠体质量增长，可通过下调高脂血症仓鼠肝脏中脂代谢相关因子Srebp2和HMCGR的基因表达，从而发挥降血脂和减少肝脏中脂质蓄积的作用，另外还能提高肝脏中抗氧化酶活性，并改善高脂饮食诱导的肝脂肪变性，发挥良好的护肝作用。

目前，高脂血症的防治已成为全世界医务及科研工作者的迫切任务。建立快速有效的高脂血症动物模型是深入研究其发病机制，开发潜在的调脂药物的关键，也是为开展后续临床研究提供可靠的基础实验结论的重要保证。仓鼠的血清脂代谢谱与人类相似，仓鼠具有繁殖速度快、抵抗力强、方便操作和血容量相对丰富的特点，与其他小动物模型相比，在高脂血症的研究上具有独特的优势[7]。本研究发现，仓鼠在经高脂饮食喂饲仅3周时，血清中TC、TG、LDL-C及HDL-C水平即上升，且在实验期间表现为持续上升的趋势，与同类研究结果一致[10-11]，表明本实验成功建立了高脂血症模型且对高脂饮食高度易感。有研究指出人类在摄入高脂饮食后血脂四项水平均升高[12]，说明仓鼠对高脂饮食的反应性与人类相似。许多流行病学研究已经确定血清LDL-C或TC水平的升高是动脉粥样硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD)发生发展的重要独立危险因素[13]，较高的血清TG水平与ASCVD独立相关[14]。降低血脂水平可减少ASCVD的发病风险[15]。本研究发现，HES能明显降低血清中TC、TG及LDL-C水平，与研究者在小鼠及仓鼠模型上观察到的结果一致[6, 16]，而对血清HDL-C水平无明显影响，与朱小琴等[8]在ApoE-/-小鼠模型上得到的结果相反，这可能是种属差异造成的，结果提示HES具有降低ASCVD患病风险的潜力。

肝脏指数是反映肝脏病变的简单方便的指标。本研究结果显示，Model组肝脂数较NC组显著升高，提示肝脏可能发生了某种病理改变。随后对肝脏中的脂质含量检测结果显示，Model组仓鼠肝脏中的脂质含量高于NC组，表明高脂饮食喂饲后引起了仓鼠肝脏中脂质的蓄积从而导致肝脏肿大，HES干预后，高脂饮食仓鼠肝脏指数及肝脏中脂质含量下降，说明HES减轻了仓鼠脂质在肝脏中的沉积。研究表明肝内胆固醇稳态的改变和游离胆固醇蓄积与非酒精性脂肪肝疾病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的发病机制有关；游离胆固醇的蓄积通过破坏线粒体和内质网膜完整性，触发线粒体氧化损伤和内质网应激，并通过促进有毒的氧固醇生成而直接损伤肝细胞，促进脂肪性肝炎和肝纤维化的发展[17-18]，NAFLD患者中肝HMGCR的表达和活性增加，且与肝组织学病变程度的严重性成正比[19]。Srebp2属于转录因子家族成员，是HMGCR的主要转录激活因子。正常生理状态下，当细胞内胆固醇水平低下时，Srebp2被激活，调节其靶基因的转录，参与胆固醇的合成、摄取、分泌及转运，从而增加细胞内胆固醇的利用率，相反，细胞内胆固醇增加会抑制Srebp2的活化。尽管NAFLD患者中肝细胞内胆固醇超负荷，Srebp2仍被异常激活，NAFLD患者中Srebp2 mRNA水平较正常人提高了3倍，Srebp2转录活性的增强是HMGCR表达增加的主要原因[20]。因此，Srebp2的上调是肝细胞内胆固醇超负荷的关键环节，提示其可能有望成为治疗NAFLD的新靶点。本研究结果显示：与Model组相比，HES组仓鼠肝脏中Srebp2和HMGCRmRNA表达水平下降，说明HES可通过抑制肝脏Srebp2和HMGCR的表达，降低肝脏中内源性胆固醇的合成，减轻脂质在肝脏内的蓄积，调节血脂水平。

临床研究表明高脂血症患者处于氧化应激状态[21]。氧化应激能促进和加重脂代谢紊乱性疾病如脂肪肝、动脉粥样硬化的病理进程[22]。TAC反映了生物体内清除自由基的总能力。MDA是自由基作用于器官膜脂质发生过氧化反应后的最终分解产物，能间接反映出机体内过氧化损伤的程度。SOD是体内一种重要的抗氧化酶，能有效清除机体内超氧阴离子自由基，其活力的改变可反映机体抗自由基损伤的能力。本研究表明HES干预可提高仓鼠肝脏中SOD活性，增强仓鼠的总抗氧化能力，降低由自由基介导的氧化应激损伤，这与研究报道的HES能够提高小鼠急性肾损伤模型中肾脏组织的抗氧化能力以及糖尿病大鼠模型睾丸组织中抗氧化酶的活性的研究结论相符[23-24]，这些研究结果说明了HES具有较好的抗氧化活性。高脂血症被公认为脂肪肝形成的“首次打击”，长期高脂血症诱导的氧化应激损伤被认为是脂肪肝发展的“二次打击”[25]。本研究观察到HES具有较好的调脂及抗氧化作用，因此推测HES对高脂饮食诱导的肝脂肪变性具有改善作用。本研究通过HE染色观察了各组仓鼠肝脏的病理学改变，发现高脂喂饲仓鼠发生了明显的肝脂肪变性，在用HES干预后，仓鼠的肝脏切片中脂质空泡细胞数量和面积明显减少，可见较为清晰的肝小叶结构，表明HES能减轻高脂饮食诱导的肝脂肪变性。血清ALT和AST活性是目前临床上最常用的反映肝实质损害的指标[26]。正常情况下，ALT和AST主要存在于细胞内，血清中的含量很低，当某种原因使细胞通透性增高或细胞膜破坏时，ALT和AST可大量释放入血，使血清中酶活性明显升高，血清ALT水平与肝脏损伤程度呈正比。本研究观察到高脂血症仓鼠血清中ALT和AST水平较NC组升高，提示长期高脂血症会引起肝损伤，而HES可降低血清中的ALT和AST水平，说明HES逆转了高脂饮食诱导的肝功能损害，具有护肝作用，这与观察到的肝脏病理学改变的结果相吻合。

综上所述，HES能抑制高脂饮食诱导的体质量增长，有效降低血脂，减少肝脏中脂质的沉积，改善高脂血症引起的肝脂肪变性，具有保护肝功能的作用，其护肝效应可能与其降脂和抗氧化活性有关。