基于GC-MS技术分析日本血吸虫寄生对钉螺代谢产物的影响

吴志蕾，何紫薇，胡 双，石莲琴，杨建发，邹丰才，黄翠琴

（1. 扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225000；2. 云南农业大学动物医学院，云南 昆明 650201；3. 龙岩学院生命科学学院/福建省家畜传染病防治与生物技术重点实验室，福建 龙岩 360012）

0 引言

【研究意义】日本血吸虫病是由日本血吸虫（Schistosoma japonicum）引起的一种严重危害人类和动物健康、影响社会经济发展的寄生虫病。湖北钉螺（Oncomelania hupensis）是日本血吸虫的唯一中间宿主，消灭钉螺是控制血吸虫病的重要措施。因此，研究钉螺代谢物及其与日本血吸虫寄生的关系，揭示日本血吸虫与钉螺互作机制，可为生物灭螺提供理论基础。【前人研究进展】 代谢组学主要研究平台包括气相色谱质谱联用（GC/MS）、液相色谱质谱联用（LC/MS）、毛细管电泳质谱联用（CE/MS）和核磁共振等[1]。目前代谢组学技术已广泛应用于疾病诊断、药物开发、营养代谢等方面，在寄生虫领域得以应用[2]。陈璐[3]运用核磁共振技术与多变量数据分析相结合的代谢组学方法，分析了减毒鼠伤寒沙门氏菌对日本血吸虫感染小鼠的代谢组的影响，为进一步了解宿主-多病原体相互作用提供了数据。Wang 等[4]应用核磁共振（NMR）技术分析了日本血吸虫单独感染引发的宿主代谢上的动态变化，结果表明宿主尿样中马尿酸、乙酸和三羧酸循环（TCA）中间产物下降，丙酮酸和肠道菌群相关代谢物含量下降。Wu等[5]进一步研究了日本血吸虫感染小鼠整个过程的体液和肝脏组织的代谢动态变化，结果说明小鼠感染后出现脂代谢紊乱、抑制TCA、促进糖酵解和肠道菌群失调等，还在尿样中发现与血吸虫病严重程度相关的特征性代谢产物3-脲基丙酸。越来越多的学者把代谢组学应用到弓形虫、鸡球虫和微孢子虫等寄生虫研究方向，为寄生虫病的早期预警和诊断提供基础，并为寄生虫病的防治提供重要依据。【本研究切入点】日本血吸虫是公共卫生研究的重要内容，过去一直从血防的角度来预防该病的发生与传播，但仍未能根除该病。对钉螺的研究，始终停留在日本血吸虫中间宿主的角度来探索。目前杀灭钉螺的措施主要有药物灭螺、生态灭螺和生物灭螺。化学药物杀螺效果较为理想，但药物对人和动物及环境都存在健康危害。在毛蚴感染钉螺后，钉螺会产生适应毛蚴及其本身生存的代谢产物，若用其自身的抑制剂研制新型灭螺药，有可能切断日本血吸虫在钉螺体内的发育，能更有针对性的消灭阳性钉螺，保持生态平衡。【拟解决的关键问题】本研究采用GC-MS技术分别对有血吸虫尾蚴寄生的钉螺和没有尾蚴寄生的钉螺进行代谢组学分析，筛选两者间的差异代谢产物，探索日本血吸虫入侵钉螺后的相互作用和代谢通路，为后续钉螺的生物控制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 样本分组

湖北钉螺样本由江苏省血吸虫病防治研究所馈赠，均采集自野外山地、田地沟渠等适宜钉螺生存的自然环境。选择其中活性较强的钉螺进行镜检观察，辨别阳性钉螺和阴性钉螺。分别收集阳性钉螺Y组和阴性钉螺W组，每5只钉螺组织为一个样本，每组设6个生物学重复，随后送至上海百趣生物公司（www.biotrre.cn）提取钉螺代谢物，并进行GC-TOF-MS代谢组学检测分析。

1.2 主要仪器

GC色谱仪（Agilent 7890A，Agilent，USA），质谱 仪 （LECO Chroma TOF PEGASUS HT，LECO，USA），研磨仪（JXFSTPRP-24，上海净信科技有限公司）。

1.3 主要试剂

L-2-氯苯丙氨酸，购自上海恒柏生物科技有限公司；硅烷化试剂（BSTFA），含1%三甲基氯硅烷（TMCS，v/v），购自REGIS Technologies. Inc. USA；代谢物提取液：甲醇、乙腈、丙酮、水的体积比为30∶30∶30∶10。

1.4 样品处理

1.4.1 钉螺镜检 （1）用灭菌4%生理盐水清洗钉螺3遍；（2）把钉螺置于载玻片，用另一片载玻片压破钉螺壳，加一滴生理盐水镜检；（3）在显微镜下观察是否有日本血吸虫胞蚴或尾蚴的存在。发现胞蚴或尾蚴的钉螺为阳性钉螺，未发现的为阴性钉螺；（4）每5只阳性钉螺、5只阴性钉螺各为1份样品组，阴阳性钉螺各提供6份样品组（30个钉螺），置于冻存管中备用提取代谢物，或在液氮中保存备用。

1.4.2 钉螺代谢物的萃取 取50 mg去壳钉螺全脏器组织样本于2 mL离心管中，加入0.4 mL提取液（甲醇、氯仿体积比为3∶1），再加入20 μL L-2氯苯丙氨酸，漩涡混匀[6]。在离心管中加入钢珠，40 Hz研磨仪处理4 min，冰浴条件下超声5 min。超声结束立即将样本置于 4℃，12 000 r·min-1离心5 min。随后取出0.34 mL上清于2 mL进样瓶（甲烷硅基化的）中。干燥后的代谢物加入80 μL甲氧胺盐试剂，混匀后放入烘箱中80°C孵育0.5 h[7]。随后每个样品中加入100 μL BSTFA，将混合物70°C孵育2 h。

1.4.3 代谢物上机检测 将已提取好的代谢物进行上机检测，上机条件：Agilent 7890气相色谱-飞行时间质谱联用仪，配有Agilent DB-5MS毛细管柱（30 m×250 μm×0.25 μm），GC-TOF-MS 具体分析条件如下：进样量1 μL，为不分流模式；载气为氦气；前进样口吹扫流速是3 mL·min-1；柱流速是1 mL·min-1；柱温在 50°C 保持1 min，再以 10°C·min-1的速率上升至290°C，保持7 min；前进样口温度280°C；传输线温度270°C；离子源温度 220°C；电离电压-70 eV；扫描方式为30-600 m/z，扫描速率20 spectra/sec；溶剂延迟460 s[8]。

1.5 代谢物检测方法

采用LECO公司的Chroma TOF2.3X软件和LECOFiehnRtx5数据库对上机得到的数据进行原始峰定性和定量，再将所得的GC-MS原始数据进行噪音数据过滤，使用内标归一法对数据进行标准化处理[9]。过滤得到的峰面积导入SIMCA软件（V14，Umetrics AB，Umea，Sweden），对数据进行多元变量模式识别分析。采用主成分分析（PCA）、正交矫正偏最小二乘法（OPLS-DA）对数据进行总览和判别分析。最后根据变量重要投影值VIP（Variable Importance in the Projection）＞1和t检验P＜0.05的标准筛选代谢产物[10]。

1.6 代谢组学数据分析

使用LECO/Fiehn代谢组学文库鉴定化合物，对原始数据进行预处理，通过软件进行原始数据的提取和过滤，目的是除去噪音数据。之后通过SIMCA软件，对归一化后的数据进行多元变量模式识别分析[11]。本试验中用主成分分析法对数据进行自动建模分析，用正交矫正偏最小二乘法判别分析方法最大化地凸显模型内部与预测主成分（Predictive component）相关的差异，最后结合t检验的P值来筛选差异性表达代谢物，分析代谢特征[11]。

2 结果与分析

2.1 系统稳定性检测

由内标（L-2-氯苯丙氨酸）保留时间（Retention time，min）来衡量，从表1中数据可以看到，其标准差为：0.001 771，说明系统十分稳定。

2.2 代谢组学谱图分析

对2组共12个样本的钉螺提取的代谢物进行GC-MS检测后，获得所有样本的总离子流色谱图（Total ion chromatogram，TIC）（图 1），横坐标表示出峰时间，纵坐标表示峰高，峰越高，表明物质含量越多，强度越大。每个峰对应一个或几个组分，图上有大量的峰，表示检测出了大量不同物质。得到的总离子流色谱图表明钉螺组织样本品质良好，峰面积可进行下一步分析。

表1 内标（L-2-氯苯丙氨酸）保留时间Table1 Retention time of internal standard （L-2-chlorophenylalanine）

2.3 差异代谢物筛选

采用OPLS-DA模型第一主成分的变量重要投影值VIP＞1标准，并结合t-test进行统计检验，结果以P＜0.05判定为两组有显著差异，具有统计学意义，由此确定差异代谢产物。多元变量统计模式识别后，过滤掉不相关的正交信号，利用上述方法筛选差异性表达代谢物[12-13]。

表2中的相似度表示与LECO-Fiehn Rtx5数据库中的匹配度，相似度＞700则鉴定为可信代谢物，相似度＜200为不确定代谢物，相似度在200～700为假定注释。通过VIP值和t检验对代谢物进行筛选，及其在载荷图中对应编号，在508个峰中筛选得到18种差异代谢产物，按差异从大到小排序为：苯甲醇、蔗糖、邻苯二甲酸二辛酯、5-氨基戊酸、3-羟基丁酸、叶绿醇、胞嘧啶、酵母氨酸、鸟嘌呤、2-单棕榈酸甘油酯、4-乙酰氨基丁酸、花生四烯酸、D-阿拉伯糖醇、2,4-二氨基丁酸、4-氨基丁酸、脯氨酸、缬氨酸和瓜氨酸（表2）。

从表2可以看出，在508个钉螺代谢产物中共筛选到18种差异代谢产物，其在阳性钉螺中的含量均远低于阴性钉螺，阳性钉螺中没有发现明显升高的物质，结果表明日本血吸虫寄生对钉螺的生理代谢产生了严重影响，其中对钉螺代谢功能影响较明显的有以下11种代谢物。

（1）苯甲醇：阴、阳性钉螺之间差异最大的代谢产物是苯甲醇，阴性组中的含量是阳性组的765倍。苯甲醇可以影响生物降解以及葡萄糖的降解，其含量变化会影响糖代谢过程[14]。

（2）D-阿拉伯糖醇：D-阿拉伯糖醇的减少也会导致机体无法正常抑制蔗糖的代谢与吸收，抑制血糖升高和脂肪生长[15]，表明阳性钉螺糖代谢途径严重受阻，导致机体能量负平衡。

图1 全部12组钉螺样本的GC-MS总离子流图Fig.1 GC-MS total ion chromatograms of 12 O. hupensis specimens

（3）邻苯二甲酸二辛酯：有类似雌激素的作用，是一种潜在的内分泌干扰物，阳性组中含量降低会影响钉螺生殖功能。

（4）4-氨基丁酸：属于非蛋白氨基酸，是一种抑制性神经递质，可调节激素分泌[16]，是三羧酸循环的重要组成部分，其含量降低严重影响机体能量循环过程，导致碳氮平衡失调[17]。

（5）3-羟基丁酸：具有抑制细胞凋亡的作用[18]，其含量的减少也会严重紊乱机体能量代谢[19]。

（6）胞嘧啶：与脂类中某些磷脂的合成密切相关[20]，其含量的异常可影响脂类的合成代谢。

（7）酵母氨酸：作为赖氨酸合成与分解代谢途径的中间物质，酵母氨酸减少反映出赖氨酸含量的变化，而赖氨酸是参与机体能量代谢和促进机体生长发育的重要氨基酸之一[21]，表明血吸虫寄生严重阻碍了钉螺自身能量代谢功能，掠夺其营养物质。

（8）2-单棕榈酸甘油酯：参与脂肪代谢，其含量的改变影响了脂肪正常的合成与分解。

（9）2,4-二氨基丁酸：是一种神经酰胺受体，可引起神经毒性，也是细胞壁的化学结构，其含量的降低会影响细胞的稳定性。

（10）脯氨酸：是机体重要能量来源，其代谢可以及时提供充足能量，并对细胞膜系统有着保护的功能；脯氨酸又是胶原蛋白主要组成成分，参与伤口愈合和组织修复，与免疫机制相关联[22]，阳性组脯氨酸含量降低导致细胞渗透压失去平衡，肝细胞发生水泡样变性。

（11）缬氨酸：是合成一种免疫抗生素的重要中间体，能够抑制蛋白质的分解[23]，其含量的异常影响了蛋白质的合成分解。

3 讨论

3.1 日本血吸虫寄生对钉螺代谢影响分析

关于寄生虫与宿主的相互作用，学者大都认同，寄生虫的寄生会影响宿主营养物质的消化吸收与能量代谢。本试验结果也表明：阳性钉螺中差异代谢物的含量比阴性钉螺低几倍甚至几百倍，血吸虫寄生造成钉螺糖代谢、能量代谢等正常功能发生障碍，损伤机体，可导致阳性钉螺死亡。

18种差异代谢物中，大多数物质都与机体糖代谢相关，其次是能量代谢。日本血吸虫寄生钉螺后，这几种代谢物含量有所减少，使钉螺无法正常维持机体免疫系统和酸碱度平衡，无法帮助肝脏排除氨毒，平衡血糖和胆固醇。导致宿主能量和营养的缺乏，糖代谢会异常加快使得钉螺体内糖贮存消化加速。另外，蔗糖和3-羟基丁酸与机体的能量代谢相关。蔗糖是重要的能量载体及来源，有机物合成应用到大部分原料，都需要由蔗糖裂解提供碳架，是生长和发育过程中的重要化合物[24]，其含量的异常影响了个体的生长和发育。3-羟基丁酸有着抑制细胞凋亡的作用[25]，其含量的减少也会严重紊乱能量代谢的功能。由此可见，日本血吸虫尾蚴寄生钉螺后抢夺其营养和能量，严重紊乱钉螺的生理代谢功能。

3.2 从代谢学角度分析钉螺防治前景

日本血吸虫病不仅危害人畜健康，还对社会经济造成严重危害。虽然过去一直从血防的角度来根治该病的发生与传播，但仍未能去除该病。该寄生虫病地域性危害严重，并且缺乏快速简易的诊断方法和有效的疫苗和药物，好在控制和研究其唯一的中间宿主钉螺，可以有效防控该病的发生与传播[26]。然而，传统的灭螺手段不仅给人类和其他生物带来致畸形、致癌等危害，还会影响环境和生态平衡。所以，需要研制新的灭螺药剂。本研究证实日本血吸虫的寄生对宿主钉螺的代谢、生长、生存和繁殖能力等造成不利影响，能否成功寄生则表现为钉螺与日本血吸虫的相容性。日本血吸虫毛蚴入侵钉螺软体后，经母胞蚴发育、子胞蚴发育、尾蚴成熟逸出几个阶段，这个过程中钉螺会释放出类黏液性质的化学物质，称为毛蚴松[27]，其能否在钉螺体内生存取决于日本血吸虫侵袭能力与宿主相互作用的结果[28]。钉螺宿主由于被寄生所导致的死亡或生殖能力下降等影响在遗传进化上也具有重要意义。

日本血吸虫在钉螺体内的寄生机制极其复杂，深入了解寄生虫与宿主之间的寄生关系可对其控制、防治提供有力依据。虽然，本次研究未能明确探索出可抑制血吸虫毛蚴在钉螺体内寄生的代谢物质，但为日本血吸虫和钉螺的防控研究提供了新思路，今后将从代谢组学角度开展更深一步研究。