一株猪圆环病毒3型的全基因序列测定及遗传进化分析

王雪涛 ，林艳，蔡雨涵，骆辉，阴文奇，李盛辟，周远成*

（1.畜科生物工程有限公司，畜禽生物制品四川省重点实验室，四川省动物生物制品工程技术研究中心，四川 成都 610200；2.四川省崇州市动物疫病预防控制中心，四川 崇州 611200）

猪圆环病毒（PCV）是一种小型单股环状无囊膜的DNA病毒，根据基因及抗原的差异性将其分为3种血清型：猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2 型（PCV2）以及新出现的猪圆环病毒3 型（PCV3）［1］。PCV1于1974年被Tischer I 等［2］在猪传代细胞中发现，被认为是一种细胞污染物，直到1982年通过离心后电镜观察才首次确认命名［3］，该病毒对猪只没有致病性。PCV2与猪圆环病毒病（PCVAD）相关，能导致断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎和肾病综合征（PDNS）、繁殖障碍等疾病，给养猪业带来极大的威协［4］。PCV3 是一种与猪皮炎和肾病综合征、生殖功能衰竭和多系统炎症相关的新型猪圆环病毒［1］。PCV3基因组全长为2 000 bp，GC含量50%，PCV3主要包括ORF1、ORF2、ORF3 三个开放阅读框（ORFs），其中ORF1 与ORF2 分别编码复制酶蛋白Rep 和抗原结构蛋白Cap，且两个ORF 呈反向排列，ORF3 编码231 个氨基酸蛋白，起始密码子不清楚。基因分析发现PCV3 与PCV2、PCV1 基因组之间的同源性较低，并且抗原蛋白Cap 之间不具有交叉保护性［5-6］。

2016 年，PCV3 首先在美国报道发现［7］，以后陆续在亚洲、欧洲、美洲的许多国家发现和流行。自2016 年以来，PCV3 已经在我国出现并流行［8-9］。PCV3 常与免疫抑制性病毒（PCV2 和PRRSV）以多重感染的形式被检出［10］，在我国也通常以混合感染的形式出现［11］。本试验通过对实验室保存送检的病料进行PCV3 阳性筛选、送检测序，以及相关基因分析，为当前PCV3分子流行病学研究提供一定的参考。

1 材料

1.1 主要试剂 2×Taq MasterMix、DL2000 DNA Marker，均购自宝日医生物技术（北京）有限公司；病毒基因组DNA 提取试剂盒购自康宁生命科学（吴江）有限公司。

1.2 相关引物 PCV3的检测采用常规PCR方法，参考GenBank 上PCV3 的基因序列，利用BioEdit软件设计PCV3 的检测引物（PCV3-Cap-F/R）和全基因引物（PCV3-全-F/R）。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息详见表1。

表1 引物信息表

2 方法

2.1 样品收集 将2019年四川各规模养殖场送检的50 份病料，包括腹泻仔猪的肠内容物、保育猪腹泻粪样、流产胎儿组织、木乃伊胎组织、繁殖障碍母猪血液、呼吸系统障碍和运动障碍育肥猪组织、腹泻母猪粪样等，前期已按照送检要求对送检样品进行过其他病原（如CSFV、PRRSV、PRV、JEV、PPV、PCV2、TGEV、PEDV 等）的检测，样品放于-80 ℃保存备用。

2.2 PCV3 检测 将收集的50 份病料研磨破碎后，用核酸提取试剂盒提取DNA，以样品中提取的DNA为模板，以设计好的检测引物PCV3-Cap-F/R进行PCV3 PCR检测。反应体系为20 μL：2×Taq MasterMix 10 μL，模板DNA 1.0 μL，PCV3-Cap-F 1.0 μL，PCV3-Cap-R 1.0 μL，ddH2O 7 μL。反应程序为：95 ℃2 min；95 ℃30 s，58 ℃45 s，72 ℃30 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。用1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

2.3 PCV3全基因组扩增 以检测出的阳性核酸为模板，用全基因引物（PCV3-全-F/R）对阳性核酸进行PCV3全基因扩增，PCR反应体系为50 μL：2×Taq MasterMix 25 μL，模 板DNA 2.0 μL，PCV3-Cap-F 2.0 μL，PCV3-Cap-R 2.0 μL，ddH2O 19 μL。反应程序为：95 ℃ 3 min；95 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃2 min，40个循环；72 ℃延伸10 min。取5 μL 用1%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。然后将剩余的45 μL送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

2.4 PCV3 基因组分析 将所得的PCV3 序列与NCBI 中的参考序列进行比对。从GenBank中挑选下载18 株PCV3 参考毒株，分别是9 株国外毒株和9株国内毒株（表2）。利用MAGA7.0软件绘制Cap 蛋白基因序列的遗传进化树，并利用MegAlign 软件对Cap 蛋白基因同源性和全基因同源性进行分析。

表2 18株PCV3参考毒株

3 结果

通过对实验室保存病料的筛选、全基因组扩增和送检测序，获得了一株病毒全基因序列，经GenBank 的BLAST 比对，确定该序列为PCV3 全基因序列，基因组长度为2 000 bp，将其命名为PCV3/CN/Sichuan/2019。

为了分析PCV3/CN/Sichuan/2019与其他PCV3毒株的遗传关系，基于抗原结构蛋白Cap基因序列，构建进化树（图1），结果显示：本次获得的毒株PCV3/CN/Sichuan/2019与国内河南毒株HeNYS-2（2017）的遗传关系最近；从整个遗传进化距离看，与国外毒株的遗传关系较远，与国内毒株（包括亚洲毒株PCV3-RU/TY17）的遗传关系较近。Cap 蛋白基因序列同源性分析结果（图2）表明，PCV3/CN/Sichuan/2019 与河南毒株HeNYS-2（2017）的同源性最高，为99.8%。与其余8 株国内毒株的同源性在99.1%～99.2%之间，与国外9株毒株的同源性在99.1%～99.3%之间。全基因序列同源性分析结果（图3）表明，PCV3/CN/Sichuan/2019与河南毒株HeNYS-2（2017）的同源性为100%，与其余8 株国内毒株的同源性在98.1%～98.8%之间，与国外9 株毒株的同源性在98.0%～98.6%之间。

4 讨论

图1 PCV3/CN/Sichuan/2019与国内外毒株Cap基因序列的遗传进化分析

图2 PCV3/CN/Sichuan/2019与国内外毒株Cap基因序列的同源性比较

图3 PCV3/CN/Sichuan/2019与国内外毒株全基因序列的同源性比较

PCV3 是近几年才在猪群中发现的圆环病毒，目前尚未见报道分离到PCV3 活毒株。其相关研究还处于前期阶段，致病性尚不清楚，临床上常以混合感染的形式出现，这加大了疾病的诊断与防控，对养殖业带来的危害亟待评估。虽然目前的研究显示PCV3与猪呼吸道疾病和腹泻有潜在的关联，但其感染机制、发病机理和生物学特性还需进一步研究，以确定PCV3 在健康猪中的影响［12-13］。

本试验获得的PCV3/CN/Sichuan/2019毒株的全基因序列与国内8株参考毒株全基因序列的同源性（98.1%～98.8%）高于与国外毒株全基因序列的同源性（98.0%～98.6%），Cap蛋白基因序列的同源性与国内外毒株基本相同（99.1%～99.3%）。从进化距离上看，与国内毒株的进化距离最近，与国外毒株的进化距离较远，且该毒株与河南毒株HeNYS-2（2017）的进化距离最近，其全基因序列的同源性高达100%，Cap蛋白基因序列的同源性高达99.8%。说明从四川某猪场分离的PCV3毒株与河南毒株相同，该毒株的Cap 蛋白基因和其他基因都发生了一点突变；与其余国内外毒株的基因序列相比，Cap 基因序列的同源性高于全基因序列的同源性，说明Cap 基因发生的碱基突变率高于其他基因，但整体上看PCV3 毒株的变异小，基因遗传进化特性稳定。

本试验从编码Cap 蛋白的ORF2 基因和全基因序列角度对PCV3 进行了遗传进化分析，希望可以为四川省PCV3的遗传变异和流行病学研究提供理论依据。