高效液相色谱法测定麝香心脑乐片中葛根素的含量

彭振宇，巫明慧，翟宏宇

（吉林省药品检验所，吉林 长春 130033）

麝香心脑乐片是由丹参、三七、红花、淫羊藿、葛根、郁金、冰片、麝香、人参茎叶总皂苷9味中药制成的糖衣片剂，具有活血化瘀，开窍止痛的功效，临床主要用于冠心病，心绞痛，心肌梗塞，脑血栓等疾病的治疗[1]。近些年来，临床应用麝香心脑乐片治疗冠心病心绞痛取得满意效果[2]。现代药理研究结果表明，麝香心脑乐片能够显著降低急性心肌梗死模型犬的血清乳酸脱氢酶和肌酸磷酸激酶的含量，具有明显的抗心肌缺血作用[3]。其标准收载于卫生部药品标准中药成分制剂第十三册，仅有简单的理化鉴别项，并未对处方中任何一味药进行定量研究。本文采用HPLC法对其处方内葛根中指标性成分——葛根素进行定量研究，为麝香心脑乐片的质量标准完善提供一定的理论依据。

1 仪器与试药

1.1 主要仪器

LC-2010C高效液相色谱仪，日本SHIMADZU；BT 125D型分析天平，德国Sartorius；KQ 700DE超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 试剂与材料

葛根素（批号：110854-201509，含量93.7%）对照品，购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈，色谱纯，Fisher；其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

麝香心脑乐片中各味药材（丹参、三七、红花、淫羊藿、葛根、郁金、冰片、麝香、人参茎叶总皂苷）购自吉林省同仁大药房有限公司，由吉林省药品检验所中药专家温立义进行了基源鉴定。麝香心脑乐片3批，购自吉林大药房，批号分别为20140201、20140601、20140901。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

LC-2010C高效液相色谱仪；Diamonsil C18 （4.6×250 mm，5 μm）色谱柱；甲醇-水(29：71)为流动相；流速1.0 mL.min-1，柱温35 ℃，检测波长为250 nm。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取葛根素对照品适量，加30%乙醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取本品20片，除去糖衣，精密称定，研细，取约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30%乙醇100 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用30%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.4 阴性对照溶液的制备

根据处方中的比例及工艺，制备缺葛根的阴性对照样品，按供试品溶液制备方法依法制成葛根的阴性对照溶液。

2.5 方法学考察

在上述的色谱条件下，分别精密吸取对照品、供试品和阴性对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果显示，阴性对照溶液在与葛根素对照品色谱峰保留时间处无色谱峰，表明阴性对照物无干扰，见图1。

2.5.1 线性关系考察

分别精密吸取对照品溶液1、3、5、10、15 μL注入色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行测定，以葛根素的含量（μg）和相应的峰面积进行线性回归，计算回归方程。

Y =6.13×106X-14132.66，r＝1.0000，结果表明葛根素在0.0892～1.3380 μg范围内线性关系良好。

Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance(A),sample(B) and negative sample without Moutan Cortex (C)

2.5.2 精密度试验

精密吸取同一份“2.3”项下供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，记录峰面积。结果显示，供试品色谱峰峰面积的RSD为0.37%，表明仪器的精密度良好。

2.5.3 稳定性试验

精密吸取“2.3”项下的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别于0，6，8，12，18 h进样，记录峰面积。结果显示，葛根素色谱峰峰面积的RSD为1.39%，表明供试品溶液中葛根素在18 h内稳定性良好。

2.5.4 重复性试验

取同一批次样品，按“2.3”项下的方法分别制备供试品溶液6份，照“2.1”项下方法测定，记录峰面积。结果显示，葛根素峰面积的RSD为1.34%，表明此方法的重复性良好。

2.5.5 回收率试验

分别精密称取样品0.5 g（含量6.02 mg·g-1），共6份，分别加入葛根素对照品适量，按“2.2”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算葛根素的回收率。结果显示，葛根素的回收率为99.70%，RSD为0.54%。具体实验结果见表1。

2.5.6 耐用性试验

实验中选取了不同厂家色谱柱（Kromasil C18、Gemini C18、Apollo C18）及不同厂家和型号的高效液相色谱仪（LC 20A、Agilent 1200）对各供试品进行测定，结果显示，不同厂家色谱柱和不同仪器均能对样品进行较好分离，适用性良好。

表1 回收率实验结果

2.6 样品测定

按照2.3项下方法制备3批样品的供试品溶液，按照2.1项下的色谱条件进行测定，记录峰面积，分别计算含量，结果见表2。

表2 含量测定结果

3 讨 论

3.1 提取方法的考察

考虑到处方中药味较多，成分复杂，为了减少测定过程中其他成分的干扰，笔者采用不同浓度甲醇和不同浓度的乙醇分别进行提取，结果显示，采用甲醇提取杂峰较多；而采用乙醇提取所得的色谱峰相对较少，基线平稳，采用30%乙醇提取时含量最高，这与相关文献报道相一致[4-9]。实验中还采用超声和回流两种方式分别进行提取，结果显示，相同的提取时间下超声提取和回流提取所得到的峰面积差不多，超声提取30 min所得的峰面积最高，增加提取时间并未显著提高含量，因此，本实验最终选取30%乙醇超声30 min进行提取。

3.2 测定波长的选择

采用紫外-可见分光光度计对葛根素对照品溶液在200～400 nm下进行全波长扫描，结果显示在250 nm附近葛根素具有最大吸收，参考《中国药典》“葛根”项下葛根素的检测波长[10]，最终选用250 nm作为测定波长。

3.3 小结

本文建立了采用HPLC法对麝香心脑乐片中葛根素含量测定方法，方法简单，快捷，重现性好，专属性强，为麝香心脑乐片中葛根的质量控制提供了一定的理论依据。