血浆外泌体miRNA诊断早期肺腺癌的临床价值

马云帆，苏晓桉，周银曦，张慧鑫

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因。肺癌高死亡率的主要原因是就诊时，80%的患者已处于晚期，预后普遍较差，5年生存率约为15%[1]。非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌的80%以上，其中肺腺癌所占比例已超越肺鳞癌，成为发病率最高的NSCLC[2]。因此，肺腺癌的早期诊断和早期治疗对改善肺癌患者的预后极其重要。目前除了低剂量螺旋CT扫描之外，还没有更为有效的方法能够早期发现肺癌，但LDCT有辐射、假阳性率高等不足之处[3]。因此，临床中迫切需要无创性生物标志物检测可以补充，甚至取代LDCT进行肺癌的筛查和早期诊断。液态活检属于新型无创性分子病理检测方式，循环miRNA检测是其中一种具有应用前景的方法[4]。但外周血中的miRNA，易受RNA酶的降解，而外泌体的膜结构可增强循环miRNA分子的稳定性，具有作为疾病生物标志物的潜力[5]。本研究根据既往研究报道，筛选miR-17-5p、miR-100-3p和miR-30a-3p三个肺腺癌血浆外泌体中表达明显变化的miRNA作为标志物[6-7]，在54例I期肺腺癌患者和45例健康个体中进行外泌体miRNA验证分析，判断这三个miRNA诊断早期肺腺癌的准确性，以期为肺癌的早期无创筛查提供新的依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 研究对象：选择宁夏医科大学总医院普胸外科2017年10月-2019年10月54例I期肺腺癌手术患者(术后病理确认)和45例健康志愿者(性别与年龄匹配)，采集其外周血，提取血浆外泌体，以验证所选择的miRNA诊断模板的准确性。具体临床资料见表1。本研究严格按照《涉及人体的生物医学研究国际伦理指南》(CIOMS)进行，研究方案经过宁夏医科大学总医院医学科研伦理审查委员会的批准(2018-283)。所有志愿者均书面同意其血浆样本、基本信息及病理信息用于本研究。

1.1.2 主要试剂与仪器：Trizol试剂(Invitrogen公司 美国)，miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRNA 荧光定量试剂盒、hsa-miR-17-5p 、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-100-3p和内参U6(天根生化科技有限公司 北京)，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、BCA 蛋白测定试剂盒(凯基生物有限公司 南京)，β-actin抗体、CD9、CD63抗体(博奥森生物技术有限公司 北京)；H7650透射电子显微镜(Hitachi公司 日本)，荧光定量 PCR 仪(ABI 公司 美国)，超速冷冻离心机(Thermo Scientific公司 美国)，电泳仪和电泳槽、转膜槽、Western blot曝光仪(Bio-Rad公司 美国)。

1.2 方法

1.2.1 血浆采集：肺腺癌患者于术前1 h 内用真空抽血管采集全血2 mL，健康志愿者采集方法相同，加入枸橼酸钠抗凝血剂，静置30 min后，在离体3 h 内完成血浆分离，保存于-80 ℃冰箱。

1.2.2 血浆外泌体提取：1 mL血浆4 ℃溶解后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)1∶10稀释后离心，在4 ℃，10 000 g下离心30 min；收集上清液，转移至超速离心管，在超速离心机4 ℃，100 000 g离心2 h；弃去上清液，并将沉淀重悬于适量的PBS中。取少量样品行外泌体鉴定，其余样品于-80 ℃保存。

1.2.3 外泌体鉴定：透射电子显微镜鉴定外泌体的形态，即取制备好的外泌体样品，滴于铜网上并静置10 min后，以2%磷钨酸染色10 min；在80 kV的加速电压下用H7650透射电子显微镜观察样品的形态，AMT数码相机拍摄透射电子显微镜观察到的图像。Western blot检测外泌体样本中的特异性蛋白CD9(24 kD)和CD63(53 kD)：转膜后，取出PVDF膜，加入配置好的荧光发光剂溶液，在Western blot曝光仪中进行曝光，采集图像。

1.2.4 外泌体中RNA提取：将提取的外泌体沉淀重悬于适量的PBS中，再向EP管中加入200 μl氯仿，颠倒混匀数次后于室温静置3 min，离心。将EP管上层RNA水相转移至新的无RNA酶EP管中，加入500 μl异丙醇，混匀后于室温静置10 min，离心；弃去上清液，加入1 mL DEPC水配制的75%无水乙醇，涡旋振荡冲洗沉淀，离心；弃去上清液，干燥5 min。根据RNA沉淀大小加入50～100 μl DEPC水，吹打混匀沉淀，置于水浴锅中55 ℃水浴10～15 min；取1 μl 制备好的RNA 进行核酸超微量测定RNA纯度和浓度，其余RNA于-80 ℃保存。

1.2.5 miR-17-5p、miR-100-3p和miR-30a-3p的qPCR引物制备：在miRBase数据库中获得miR-17-5p、miR-100-3p和miR-30a-3p的成熟序列，qPCR引物由北京天根生化科技有限公司制备提供。miR-17-5p:5-GTCAGAATAATGTCAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGTGATATGTGCATCTACTGCAGTGAAGGCACTTGTAGCATTATGGTGAC-3’；miR-100-3p:5-CCTGTTGCCACAAACCCGTAGATCCGAACTTGTGGTATTAGTCCGCACAAGCTTGTATCTATAGGTATGGTCTGTTAGG-3’；miR-30a-3p:5-GCGACTGTAAACATCCTCGACTGGAAGCTGTGAAGCCACAGATGGGCTTTCAGTCGGATGTTTGCAGCTGC-3’。

1.2.6 qPCR检测miRNA的相对表达量：采用miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒操作合成cDNA，完成RNA反转录。采用miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒进行qPCR，检测外泌体样品中miR-17-5p、miR-100-3p和miR-30a-3p的相对表达量。检测重复三次，取CT值的均值进行最终计算。使用内参U6进行校准，2-△CT法分析数据结果。根据相对定量公式计算检测结果，最终计算公式：改变的倍数(fold change)= 2-△CT；△△CT =(CT靶基因-CT内参)处理组-(CT靶基因-CT内参)未处理组。

2 结果

2.1 早期肺腺癌组和健康对照组临床资料比较：早期肺腺癌组患者54例，平均年龄(59.22±7.81)岁，其中原位癌11例、Stage IA 19例、Stage IB 24例；健康志愿者组48例，平均年龄(53.93±8.96)。2组间年龄、性别和吸烟史比较差异无统计学意义 (P>0.05)，见表1。

表1 肺腺癌患者和健康个体的临床特征

2.2 血浆外泌体特征：根据MISEV 2018[8]，使用Western blot检测了肺腺癌患者与健康志愿者血浆外泌体样本中的2个标志物：CD9和CD63。WB结果均可见到明显的CD63和CD9条带，见图1a(目录后)。透射电镜结果表明，肺腺癌患者与健康志愿者血浆中分离出的囊泡大部分在100 nm左右，均有一个杯状双层膜结构，为典型的外泌体图像，见图1b(目录后)。

2.3 qPCR验证miR-17、miR-100和miR-30a-3p相对表达水平：肺腺癌组与健康志愿者组中miR-17-5p、miR-100-3p和miR-30a-3p的相对表达水平，见表2。分析结果显示，肺腺癌患者组血浆外泌体中的miR-17-5p较健康志愿者组相对表达水平高，差异有统计学意义(P<0.05)；肺腺癌患者组血浆外泌体中的miR-100-3p较健康志愿者组相对表达水平低，差异有统计学意义(P<0.05)；肺腺癌患者血浆外泌体中miR-30a-3p较健康志愿者的相对表达水平升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 2组miR-17-5p、miR-100-3p和miR-30a-3p相对表达水平比较

2.4 血浆外泌体miR-17-5p和miR-100-3p诊断早期肺腺癌的ROC曲线分析：ROC曲线分析评价血浆外泌体miR-17-5p、miR-100-3p及其二者联合诊断早期肺腺癌的准确性。miR-17-5p的AUC值为0.870，差异有统计学意义(P<0.05)，诊断灵敏度和特异度分别为88.9%和71.1%；miR-100-5p的AUC值为0.777，差异有统计学意义(P<0.05)，诊断灵敏度和特异度分别为70.4%和77.8%；使用miR-17-5p/miR-100-3p联合诊断早期肺腺癌(通过miR-17-5p/miR-100-3p△Ct的差值来计算)，AUC值为0.905，诊断灵敏度和特异度分别为83.3%和88.9%，见表3。

表3 血浆外泌体miRNA诊断早期肺腺癌的ROC曲线分析

3 讨论

本研究通过提取血浆外泌体miRNA并经qPCR检测，验证了早期肺腺癌患者与健康个体相比，血浆外泌体中miR-17-5p相对表达升高，miR-100-3p相对表达下降，而miR-30a-3p虽然较健康志愿者的相对表达水平升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。此外，ROC曲线分析显示，血浆外泌体miR-17-5p诊断早期肺腺癌的灵敏度和特异度分别为88.9%和71.1%，miR-100-5p诊断灵敏度和特异度分别为70.4%和77.8%，miR-17-5p/miR-100-3p联合诊断的灵敏度和特异度分别为83.3%和88.9%。以上结果表明miR-17-5p和miR-100-3p这两种血浆外泌体miRNA可能在肺腺癌的早期筛查中发挥作用，而且二者联合应用诊断的准确性更优。

外泌体是一种双层膜结构的囊性小泡，直径30～100 nm[9]，广泛存在于人体体液中，包括血液、唾液、尿液等[10]。外泌体中含有蛋白质、细胞因子、转录因子受体、mRNA和miRNA等多种生物活性物质。外泌体携带和传递重要的信号分子，形成了一种全新的细胞间信息传递系统，影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关。相比正常细胞，肿瘤细胞会分泌更多的外泌体，并且含有与肿瘤相关的遗传信息。血液中含有丰富的RNA酶，循环miRNA在血液中可能被降解，影响其检测的稳定性。有研究发现外周血中存在的外泌体因其特有的膜状结构，可以保护其内部的循环miRNA，使其免受RNA酶的降解[11]。由于外泌体miRNA的稳定性和miRNA的富集，可能更适合开发诊断性生物标志物。

miR-17-5p和miR-100-3p在肿瘤发生的相关机制中，发挥着不同的作用。miR-17-92簇是由多顺反子RNA编码的6种不同的miRNA组成，它们异常表达与多种癌症的病理过程相关，可以通过多种分子机制来调节其靶基因[12-13]。miR-17-5p是miR-17-92簇的一员，有研究报道非小细胞肺癌患者血外泌体源性miR-17-5p 表达较健康个体明显升高[14]。既往研究发现，肺癌中miR-100的表达下调，表明其可能发挥了肿瘤抑制功能[15]。另有研究报道，在非小细胞肺癌细胞中过表达miR-100可通过FGFR3抑制肿瘤的生长、迁移和化疗敏感性[16]。

尽管miR-30a-3p在本研究中是非特异性增高的指标，但仍有研究显示肺腺癌患者与健康个体相比，血浆外泌体中此miRNA表达量较高，且差异有统计学意义[7]。这可能是因为所研究的人群差异，或是本研究样本量较小导致结果不符，因此，对于miR-30a-3p仍需要进行大样本验证，来判定此miRNA是否可作为检测早期肺腺癌的合适的生物标志物。在有关疾病特异的循环外泌体miRNA种类及表达水平的研究中，结果往往并不一致，肺癌的研究同样如此[6-7,17-18]，究其原因与检测方法和检测人群的差异等多种因素有关。因此外泌体miRNA作为诊断标志物的应用可能会受到一定限制，改进外泌体miRNA检测方法和寻找表达更为稳定、特异的miRNA指标是今后研究的一个方向。