HPLC法测定石龙清血颗粒中莫诺苷和马钱苷的含量

齐喜红，高 萌，李 昕，张芦燕，王 庆

石龙清血颗粒全方由山茱萸、钩藤等十四味药组成，具有滋阴潜阳、平肝熄风、化瘀止血的功效，用于肝阳化风、脑脉瘀阻所致中风等症状。山茱萸为处方中的主要药味，具有抗菌、抗炎、调节免疫、降血糖等作用。目前认为其主要活性成分为环烯醚萜苷，而莫诺苷和马钱苷均属于此类成分[1-2]。但因产区不同其化学成分差异较大，河南南阳与山西阳城产的山茱萸马钱苷含量高，山西阳城与浙江杭州产的山茱萸莫诺苷含量高[3]。因此，本实验参考相关文献[4-7]，研究建立了HPLC法同时测定二者含量，为石龙清血颗粒中山茱萸的质量控制提供技术支撑。

1 资料与方法

1.1 一般资料：Agilent 1260型的高效液相色谱仪，二极管阵列检测器，Elma超声清洗仪，梅特勒XS205电子天平。

1.2 材料：莫诺苷对照品(批号：111998-201501)、马钱苷对照品(批号：111640-201005)均购于中国食品药品检定研究院。试剂乙腈为色谱纯，水为高纯水，甲醇和乙醇为分析纯。5批石龙清血颗粒样品为吉林省健今药业股份有限公司生产(批号分别为：20120301、20120302、20120303、20140708、20141103)。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液制备：取莫诺苷和马钱苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL含莫诺苷和马钱苷分别为26.4、28.7 μg的混合溶液，即得。

1.3.2 供试品溶液制备：取本品，研细，取约1g，精密称定，精密加入50%甲醇溶液25mL，密塞，称重。超声(250 W， 40 Hz)提取35 min，放至室温，再称重后用50%的甲醇补重。摇匀后用0.45 μm的滤膜滤过，取用续滤液，即得。

1.3.3 阴性溶液制备：参照石龙清血颗粒的处方组成，制得缺山茱萸阴性供试品，以“2.2”项下方法，制备阴性样品溶液。

1.3.4 色谱条件：色谱柱为Phenomenex Gemini C18 110A(250 mm×4.6 mm， 5μm)，以乙腈为流动相A，以0.3%磷酸溶液为流动相B；按表1进行梯度洗脱，检测波长240 nm，流速1.0 mL/min，柱温40 ℃。

表1 梯度洗脱程序

2 结果

2.1 专属性试验结果：取对照品溶液、样品溶液及阴性溶液，以“2.4”项的色谱条件测试，结果表明样品色谱图中，在与莫诺苷和马钱苷对照品色谱相应的保留时间有相同色谱峰，而阴性样品溶液在相应保留时间处无干扰。

2.2 线性关系考察：精密吸取对照品混合溶液(每1 mL含莫诺苷15.51 μg，马钱苷17.56 μg)0.4、1、2、3、4 mL至10 mL棕色容量瓶中，滴加甲醇至刻度，摇匀。按“2.4”项下的方法进行测定。以浓度(X)作为横坐标，峰面积(Y)作为纵坐标，计算线性回归。回归方程与相关系数为：Y=1 639X-8.235(r=0.999 9)、Y=1 446.7X+0.373 4(r=1.000 0)。结果表明莫诺苷在0.062～0.776 μg、马钱苷在0.07～0.878 μg范围内具有较好线性关系。

2.3 精密度考察:吸取混合对照溶液，连续进样5次。结果显示，莫诺苷、马钱苷峰面积的RSD分别为0.67%和0.41%，说明仪器的精密度良好。

2.4 重复性试验：取同一样品6份，以“2.2”项下方法制得供试品溶液，进行测定。测得莫诺苷和马钱苷的平均含量分别为0.58、0.50 mg/g，RSD为1.30%和1.66%，表明此法重复性良好。

2.5 稳定性考察：取同一样品溶液，每隔2 h 进样1次，连续进样10次。结果莫诺苷和马钱苷峰面积的RSD分别为0.88%和0.59%，表明样品中莫诺苷和马钱苷在18 h 内较稳定。

2.6 加样回收率试验：精密称取已知含量的石龙清血颗粒样品0.5 g，精密称定6份，分别精密加入混合对照品溶液(莫诺苷12.04 mg/L、马钱苷11.39 mg/L)25 mL，按“2.2”项下的方法制取供试品溶液，进行测定。计算2个成分的加样回收率，测得结果见表2。

表2 石龙清血颗粒中2种成分的准确度试验

2.7 样品含量测定：取5批石龙清血颗粒样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下方法进行测定，见表3。

表3 石龙清血颗粒中各成分的含量测定

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

3.1.1 检测波长的选择：通过二极管阵列检测器进行全波长扫描(190～400 nm)，莫诺苷和马钱苷的最大吸收波长分别为240 nm和236 nm，结合现版药典[8]，本次试验最终选用240 nm作为测定波长。

3.1.2 流动相的选择：采用甲醇-水梯度洗脱，乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脱及乙腈-0.1%甲酸溶液进行试验，结合高效液相色谱图，最终确定本文的流动相系统。

3.2 样品提取条件的优化：本实验对比了加热回流提取法和超声提取法，结果发现2种方法提取率相近，考虑超声简便快捷，故实验选择超声提取法。同时考察了不同浓度的甲醇提取液，最终选用了50%的甲醇溶液作为本次试验的提取溶剂。

本实验采用HPLC法测定石龙清血颗粒中山茱萸的含量，该方法具有操作简便，分离度和重现性良好，专属性强等特点，能有效控制石龙清血颗粒中山茱萸的质量。