高效液相色谱法检测紫苏梗提取物活性成分及抗氧化效果

张 蕾, 李秋双, 郝婧玮, 宛春雷, 景云荣, 柴军红, 纪秋妍

(牡丹江师范学院 生命科学与技术学院, 黑龙江 牡丹江 157011)

紫苏梗(Perillastem)为唇形科紫苏属植物紫苏 (Perillafrutescens(L.) Brit)的干燥茎部分, 别名紫苏茎、 苏梗、 紫苏杆. 梗性温, 味辛, 气味芳香, 分布广泛, 具有理气宽中、 止痛、 安胎等功效[1], 常用于治疗水肿、 心腹气滞、 肾气游风等症. 研究表明, 紫苏梗具有降糖、 影响结肠平滑肌细胞等作用[2-5]. 紫苏含有多种化学成分, 如酚酸类(迷迭香酸为主)、 花色素苷、 黄酮苷、 紫苏酮、 石竹烯、 紫苏醛[6]、 齐墩果酸、 乌索酸、 熊果酸、 阿魏酸、 咖啡酸及其酯类衍生物、 迷迭香酸、 迷迭香酸甲酯、 丁香酚、 脂肪酸以及甾醇类化合物等. 紫苏梗中含有多种黄酮类化合物, 如黄酮类、 二氢黄酮类、 黄酮醇类、 二氢黄酮醇类等[7], 其中黄酮类化合物和迷迭香酸均具有抗菌、 抗氧化及清除自由基等活性[8-10]. 生物体内的自由基可使体内脂质过氧化, 导致机体逐渐衰老或发生疾病. 紫苏梗中含有丰富的黄酮类化合物[7], 该类化合物中的酚羟基对各种自由基均有较强的清除能力[11-14]. 目前对紫苏抗氧化作用的研究文献报道较少. 本文用不同有机溶剂和水提取中草药紫苏梗中的多种有效成分, 并用不同方法研究各提取物的抗氧化效果, 为探索紫苏梗药用成分防治相关临床疾病机理的研究提供参考数据.

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

紫苏梗购于牡丹江市天利药店； 没食子酸、 金丝桃苷购于四川维克奇生物科技有限公司； 齐墩果酸购于贵州迪大生物科技有限责任公司； 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)、 邻苯三酚购于成都生物制品研究所.

Waters2998型高效液相色谱仪(美国Waters公司).

1.2 方 法

1.2.1 制备紫苏梗提取物 将5 kg紫苏梗晾晒除湿后粉碎. 用体积分数为95%的乙醇浸泡12 h,m(料)∶V(液)=1∶2, 充分搅拌. 重复浸提3次, 使紫苏梗中的化学成分溶解于乙醇中. 用旋转蒸发仪处理浸提液后得到乙醇提取相. 紫苏梗各有机相提取物简称为某有机相.

1) 有机溶剂萃取紫苏梗提取物. 用石油醚、 乙酸乙酯、 氯仿、 正丁醇4种有机溶剂以1∶1的体积比分别萃取紫苏梗的乙醇提取液至无色, 获得的萃取液即为紫苏梗正丁醇相、 紫苏梗氯仿相(黄酮类和生物碱类化合物)、 紫苏梗乙酸乙酯相(有机酸类和香豆素类化合物)、 紫苏梗石油醚相(油脂和三萜类化合物)[15], 蒸干溶剂, 最终获得紫苏梗提取物粉末, 分别为石油醚相20.8 g、 氯仿相29.7 g、 乙酸乙酯相34.5 g和正丁醇相26.4 g. 用无水乙醇溶解各萃取物, 配制成质量浓度为1 g/mL的母液.

2) 紫苏梗水提取物. 先将200 g紫苏梗溶于1 L蒸馏水中, 浸泡30 min, 再加入1 L蒸馏水, 煎煮至约50 mL, 过滤, 得到质量浓度为0.1 g/mL紫苏梗水提物母液.

1.2.2 抗氧化效果

1) 清除羟基自由基(·OH)能力测定. 准备若干具塞试管分别进行标记, 取pH=7.4的磷酸盐缓冲液2 mL和邻二氮菲溶液1 mL(1.5 mmol/L), 加入每个具塞试管中, 充分摇匀后, 先加入FeSO4溶液1 mL(1.5 mmol/L), 混匀, 再加入φ(H2O2)=0.02%溶液1 mL或不同的紫苏梗提取液1 mL, 最后加入φ(H2O2)=0.02%溶液1 mL, 摇匀. 分别向每个具塞试管中加入蒸馏水定容至8 mL, 先在37 ℃恒温水浴锅中水浴加热1 h, 再在波长为510 nm处测量其吸光度[16]. ·OH的清除率为

·OH清除率=[(A1-A2)/(A3-A4)]×100%,

(1)

其中：A1为仅加样品和空白溶液的吸光度;A2为加H2O2溶液和样品溶液的空白溶液吸光度;A3为不加H2O2和样品空白溶液的吸光度;A4为仅加H2O2溶液和空白溶液的吸光度.

邻苯三酚自氧化速率的测定： 参照文献[16], 取pH=8.2的Tris-HCl缓冲液5 mL(50 mmol/L)于具塞试管中, 向其加入邻苯三酚溶液5 μL(50 mmol/L), 摇匀, 在波长为325 nm处测量其吸光度, 每隔0.5 min测量一次, 测定3.5 min, 共测5次, 取平均值.

(2)

其中： ΔAa为邻苯三酚自氧化吸光值(3.5 min时吸光度值与初始时吸光值之差); ΔAb为样品的吸光值(3.5 min时吸光度值与初始时吸光值之差).

3) 清除DPPH·自由基的能力测定. 利用Saiga原理[17], 取3个具塞试管, 分别标记为1,2,3. 分别装入2.5 mL DPPH·溶液和1.5 mL不同的紫苏梗提取液、 2.5 mL DPPH·溶液和1.5 mLφ(乙醇)=95%溶液及1.5 mL不同的提取物溶液和2.5 mLφ(乙醇)=95%溶液. 用φ(乙醇)=95%溶液作为参比溶液, 具塞试管中溶液充分摇匀后, 在黑暗条件下反应20 min, 反应结束后, 在波长为525 nm处测量其吸光值. DPPH·的清除率为

DPPH·清除率=[1-(A1-A3)/A2]×100%,

(3)

其中：A1为DPPH·溶液与不同质量浓度紫苏梗混合溶液的吸光度值;A2为DPPH·溶液与φ(乙醇)=95%溶液混合溶液的吸光度值;A3为不同质量浓度紫苏梗与φ(乙醇)=95%溶液混合溶液的吸光度值.

1.2.3 高效液相色谱(HPLC)条件 色谱柱. 没食子酸流动相：V(甲醇)∶V(水)=1∶4, 流速为1 mL/ min, 柱温为23 ℃, 记录仪纸速为0.3 cm/min, 进样量10 μL, 检测波长为270 nm, 平行进样3次.

齐墩果酸流动相：V(乙腈)∶V(水)=9, 流速为1 mL/min, 柱温为23 ℃, 记录仪纸速为0.3 cm/min, 进样量10 μL, 检测波长为210 nm, 平行进样3次.

金丝桃苷流动相：V(乙腈)∶V(水)=16∶84, 流速为1 mL/min, 柱温为23 ℃, 记录仪纸速为0.3 cm/min, 进样量10 μL, 检测波长为360 nm, 平行进样3次.

以标准品峰面积为纵坐标, 对照品质量浓度1.56,6.25,12.5,25,50,100 μg/mL为横坐标, 绘制标准曲线.

1.3 统计分析

用SPSS13.0软件进行数据统计分析.

2 结果与讨论

2.1 高效液相色谱法测量紫苏梗各提取相中活性物质的含量

用高效液相法绘制各种标准品的标准曲线分别为

没食子酸：y=1 442.6x-5 710.2,R2=0.990 6；

齐墩果酸：y=4 654.1x-6 510.7,R2=0.998 2；

金丝桃苷：y= 20 885x-17 782,R2=0.999 2.

各提取相的高效液相色谱如图1所示. 有机酸类物质具有抗氧化、 抑菌、 消炎、 抗病毒等作用[18], 在食品、 医药等领域应用广泛. 乙醇和正丁醇提取相中的主要成分为有机酸类物质, 没食子酸是有机酸的一种, 具有一定的抗氧化效果[19-20]. 用反高效液相色谱法测定的正丁醇提取相中存在没食子酸, 保留时间均为5.346 min, 根据峰面积计算得到没食子酸的质量比为0.6 g/kg, 得率为0.06%(图1(A),(B)). 药用植物中的三萜皂苷具有抗氧化、 抑菌、 降糖等药理活性, 在紫苏梗中含有齐墩果酸[21], 从紫苏梗氯仿相中发现三萜类化合物齐墩果酸的保留时间为11.286 min, 根据峰面积计算得到紫苏梗氯仿相中齐墩果酸的质量比为0.9 g/kg, 得率为0.09%(图1(C),(D)). 由于黄酮类化合物具有一定的抗氧化效果[22-23], 金丝桃苷属于黄酮醇苷类化合物, 因此金丝桃苷在体内有一定的抗氧化效果[24]. 在紫苏梗乙酸乙酯和氯仿提取相中金丝桃苷的保留时间为26.039 min, 根据峰面积计算得到乙酸乙酯相中金丝桃苷的质量比为1.2 g/kg, 得率为0.12%； 氯仿相中金丝桃苷的质量比为1.1 g/kg, 得率为0.11%(图1(E),(F),(G)).

图1 紫苏梗各提取相中的有效成分

2.2 抗氧化结果

图2 紫苏梗各提取相对·OH的清除能力

1) 对羟基自由基(·OH)的清除能力. ·OH是导致组织细胞损伤的主要活性氧之一[25]. 紫苏梗各提取相对·OH的清除能力如图2所示. 由图2可见, 1 mg/mL的紫苏梗乙酸乙酯提取相对·OH的清除能力最强, 清除率达79%; 正丁醇提取相对·OH清除能力最弱.

3) 对DPPH·的清除能力. DPPH·可用于抗氧化成分的体外抗氧化性评价. 紫苏梗各提取相对DPPH·均有一定的清除能力, 结果如图4所示. 由图4可见: 乙酸乙酯提取相清除DPPH·能力最强, 清除率达83%; 氯仿与正丁醇提取相物清除DPPH·的能力相近.

图3 紫苏梗各提取相对的清除能力

图4 紫苏梗各提取相对DPPH·的清除能力

综上可见, 紫苏梗各提取相均具有不同程度的抗氧化作用, 对超氧自由基、 羟自由基及DPPH·自由基均有一定的清除能力.