尿液中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mRNA表达量与IgA肾病患者肾脏纤维化的相关性研究

汪裕伟，曹玉涵

(皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 肾脏内科,安徽 芜湖 241001)

慢性肾脏疾病(chronic renal disease，CKD)是严重威胁人群健康的慢性疾病。流行病学资料显示中国CKD的发病率已高达10.8%[1]。IgA肾病是CKD中的主要病理类型。IgA肾病的发病机制涉及复杂的病理生理过程，包括IgA1分子异常[2]、免疫调节异常[3]、足细胞损伤[4]、小管间质纤维瘢痕形成[5]、遗传因素[6]、环境因素[7]等。肾脏纤维化是所有慢性肾脏疾病的最终结局[8]。早期精确诊断IgA肾病和肾脏纤维化对于延缓疾病进展，改善患者生存具有重要的意义。目前诊断肾脏纤维化依赖肾脏穿刺活检。肾脏穿刺活检是一项有创性检查，有发生出血等严重并发症的风险，重复穿刺活检难以实现[9]。传统的反映肾功能的标志物如血肌酐、尿素氮、胱抑素C等无法诊断肾脏纤维化。因此，找到一种无创的、能够诊断不同病理类型以及肾脏纤维化的生物标志物，对慢性肾脏疾病的诊疗策略意义重大。

近年来，以实时定量聚合酶链式扩增反应(real time polymerase chain reaction，RT-PCR)为基础的尿液RNA生物标志物检测逐渐受到重视。既往的研究提示尿液RNA可作为CKD和肾脏纤维化的生物标志物[10]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin， mTOR)是一种调控细胞增殖，炎症反应和免疫反应的关键信号蛋白。有学者发现mTOR和CKD之间存在显著的相关性[11]。本研究旨在探讨尿液中mTOR mRNA表达量与肾脏纤维化的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究设计 本研究共选择2017～2018年在弋矶山医院肾脏内科住院治疗的98例肾脏穿刺活检证实的IgA肾病患者和42例健康对照。排除标准：①年龄<18周岁或>80周岁；②肝功能不全；③泌尿系统感染性疾病；④恶性肿瘤；⑤器官移植术后；⑥严重心血管系统疾病；⑦正在使用激素和(或)免疫制剂。肾脏穿刺活检后24 h收集晨尿200 mL。本研究经弋矶山医院伦理委员会批准，所有入选患者均签署知情同意书。

1.2 尿液中RNA提取 晨尿样本经4℃，3000 r/min，离心30 min后，弃去上清，收集沉渣，重悬于1.5 mL DEPC处理过的PBS溶液中，4℃，13 000 r/min，离心5 min，再次收集沉渣，重悬于1 mL TRIzol中，-80℃保存。使用Ambion总RNA提取试剂盒提取沉渣中的总RNA。使用NanoDrop 2000测定RNA的A260/280比值。18 sRNA作为PCR内参。

1.3 实时定量PCR 设计引物如下，mTOR正向引物，sense:5-TCCGAGAGATGAGTCAAGAGG-3；反向引物：5-CACCTTCCACTCCTATGAGGC-3。18 s RNA正向引物：5-CATGCTAACTAGTTACGCGACC-3；反向引物：5-GAGCAATAACAGGTCTGTGATG-3。实时定量PCR反应程序：反转录(50℃，3 min)，热启动(94°C,15 min)，40～42个PCR循环(94°C,1 min;52.5°C,1 min;72°C,1 min)。

1.4 肾脏纤维化检测 肾脏穿刺活检样本制成石蜡切片。切片厚度3 μm。使用Masson染色、PAS染色评估肾脏纤维化、肾小球硬化。由两位病理科医生分别分析染色结果。无-轻度纤维化：纤维化面积0～25%；中度纤维化：纤维化面积26%～50%；重度纤维化：纤维化面积>50%。使用IgA肾病牛津分型 MEST-C 评价系统包括系膜细胞增生(M0/1)；内皮细胞增生(E0/1)；肾小球节段性硬化(S0/1)；肾小管萎缩/间质纤维化(T0/1/2)和新月体形成(C0/1)[12]。

2 结果

2.1 入选患者与健康者的基线临床和病理资料对比 肾小球滤过率(eGFR)使用MDRD公式计算[13]。肾穿刺病理活检报告采用IgA肾病牛津分级评分，98例IgA肾病患者中，M1为98例，E0和E1分别为54例和44例，S0和S1分别为46例和52例，T0、T1和T2分别为54例、34例和10例，C0、C1和C2分别为84例、10例和4例。结果显示，IgA肾病组在年龄、血肌酐、血尿素氮、胱抑素C、收缩压、舒张压和mTOR表达量上均高于健康对照组(P<0.05)，eGFR低于健康对照组(P<0.05)；而两组在性别上差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2 不同程度患者基线临床和病理资料对比 根据纤维化严重程度将98例IgA肾病患者分为2组：无-轻度纤维化组(n=54)、中-重度纤维化组(n=44)。中-重度纤维化组年龄、血肌酐、尿素氮、胱抑素C、24 h尿蛋白定量、收缩压和舒张压均高于无-轻度纤维化组(P<0.05)，而eGFR、mTOR均低于无-轻度纤维化组(P<0.05)；两组在性别、ACRI/ARB和利尿剂使用情况上差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表1 IgA肾病患者与健康者的基线临床和病理资料对比

表2 IgA肾病患者临床和病理资料

2.3 mTOR表达量与临床和病理指标的相关性 Spearman相关性分析显示，尿液mTOR表达量与血肌酐(rs=-0.415，P=0.000)、尿素氮(rs=-0.463，P=0.000)、24 h尿蛋白(rs=-0.201，P=0.039)、胱抑素C(rs=-0.401，P=0.042)、肾小球评分(rs=-0.463，P<0.001)和肾小管损伤评分(rs=-0.482，P<0.001)呈负相关，与eGFR(rs=0.467，P=0.000)呈正相关。

2.4 尿液mTOR表达量对IgA肾病和肾脏纤维化的诊断价值 ROC分析提示尿液mTOR表达量、eGFR、血肌酐、胱抑素C、尿素氮对诊断IgA肾病均有统计学意义(尿液mTOR表达量AUC 0.896,95%CI：0.831～0.961，P<0.001;eGFR AUC 0.733,95%CI：0.641～0.825,P<0.001;血肌酐 AUC 0.744，95%CI：0.649～0.838,P<0.001;胱抑素C AUC 0.664，95%CI：0.574～0.755,P=0.002;尿素氮 AUC 0.624，95%CI：0.511～0.737,P=0.020)，详见图1A。选择0.323为截断值，尿液mTOR诊断IgA肾病能够达到最高诊断效能，即灵敏度86.7%和特异度88.1%。

通过ROC分析进一步研究提示尿液mTOR表达量可区分IgA肾病患者无-轻度纤维化和中-重度纤维化水平(AUC 0.875,95%CI：0.789～0.962，P<0.001)。当mTOR表达量为0.273时，尿液mTOR诊断IgA肾病不同程度的肾脏纤维化水平能够达到最高诊断效能，灵敏度86.4%和特异度94.4%。

A：ROC曲线分析mTOR表达量、eGFR、血肌酐、胱抑素C、尿素氮对IgA肾病的诊断价值；B：ROC曲线分析尿液mTOR表达量对IgA肾病患者无-轻度纤维化和中-重度纤维化水平的诊断价值。

3 讨论

早期无创性诊断CKD和肾脏纤维化是临床工作中面临的难题。传统的生物标志物如血肌酐、尿素氮、eGFR等无法诊断CKD的病理类型。目前为止尚无可靠的无创诊断肾脏纤维化的生物标志物。IgA肾病是最常见的CKD病理类型。既往的研究提示肾组织CD147表达量是IgA肾病的潜在生物标志物[14]。此外，也有研究认为肾小球和肾小管特异性的miRNA与IgA肾病有关[15]。然而，肾组织特异性的分子检测仍依赖肾脏穿刺活检，而重复性穿刺活检在临床实践中难以实现。目前为止仍然缺乏无创的肾脏纤维化的生物标志物。

尿液中蕴含着丰富的可以反映肾脏病变的生物学信息。肾脏纤维化相关的分子可能在尿沉渣细胞中表达，而沉渣细胞中包含足细胞、小管上皮细胞等肾脏固有细胞。近些年来，实时定量PCR技术开始用于筛选尿沉渣细胞中可能的生物标志物分子。Li等[16]首次采用PCR构建肾移植后免疫排异反应相关分子的检测方法。RT-PCR具有灵敏度高、可重复性好、无创等诸多优势，是构建肾脏纤维化相关分子检测的可靠手段。大量研究均显示尿液中蕴含的mRNA可作为CKD的可靠的生物标志物[17]。Zhou等[18]进一步发现尿液中的mRNA可早期诊断肾脏纤维化。本研究的结果显示RT-PCR是筛选尿液中IgA肾病和肾脏纤维化的可靠检测手段。

mTOR是调控细胞增殖、炎症反应和免疫系统的关键分子[19]。有研究提示mTOR参与了肾脏纤维化的过程。Zhang等[20]发现mTOR信号通路调控急性肾损伤中的免疫反应。mTOR也是治疗肾脏疾病的潜在的靶点。此外，有学者发现mTOR在肾脏纤维化过程中同样发挥重要的作用[21]。本研究发现IgA肾病患者尿液中mTOR表达显著下降，尿液中mTOR是IgA肾病的潜在生物标志物。

mTOR不仅是信号通路的关键分子，同样也是多种疾病诸如癌症，免疫系统疾病和代谢性疾病的潜在生物标志物[22]。mTOR抑制剂可减轻肾脏损伤[23]，但是mTOR可否作为肾脏纤维化的生物标志物仍未明确。本研究显示尿液中mTOR mRNA表达水平与肾脏纤维化程度存在显著的相关性。此外，ROC曲线显示尿液中mTOR表达量可诊断IgA肾病和肾脏纤维化。尿液中mTOR可作为诊断IgA肾病和肾脏纤维化的无创生物标志物。

本研究基于尿液中mRNA检测，初步发现了尿液中mTOR mRNA检测可作为诊断IgA肾病和肾脏纤维化的可靠的无创性检测手段。尿液中mTOR mRNA表达量可作为IgA肾病和肾脏纤维化的生物标志物，为临床实践中早期无创诊断IgA肾病和肾脏纤维化提供了新的潜在的手段。