木瓜蛋白酶水解大豆蛋白制备啤酒糖浆复配液的研究

罗建勇，史一白，刘泽瑾，吴晨孛，钱 芳，，郭 峰，黄立新

（1.广州双桥股份有限公司，广东广州 510280；2.华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）

木瓜蛋白酶是由212个氨基酸单元组成的巯基蛋白酶，具有较宽的底物特异性；分子量约23 400，等电点8.75，最适pH值6～7，最适温度55～65℃，耐热性强，在90℃时也不完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。木瓜蛋白酶商品是由番木瓜（Carica papya L.）的果汁和叶子分离而得的蛋白酶混合物的酶制剂，包含蛋白酶、凝乳蛋白酶、溶菌酶等，多呈淡褐色无定形粉末或颗粒，微吸湿，微有硫化氢臭味[1]，在国内有广泛的来源。

木瓜蛋白酶具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等优点，即使在食品领域，应用也非常广，比如用于酶解动物蛋白[2-5]，以及花生[6]、玉米[7]、核桃[8]、米糠[9]和大豆[10-14]等的植物蛋白，用于改性蛋白，作为保健和药物功能配料，都具有非常好的效果。

在前期研究基础上，采用木瓜蛋白酶在不同的水解条件下酶解大豆蛋白，研究测定其大豆蛋白酶解液的蛋白质回收率、水解度、隆丁（Lundin）区分变化及SDS-PAGE凝胶电泳，探讨水解制备大豆蛋白酶解发酵液的条件，使之接近或者相当于麦芽汁隆丁区分的一般要求：高分子含氮物质占25%，中分子含氮物质占15%，低分子含氮物质占60%，有丰富的有机氮元素和良好风味，作为发酵的氮源与啤酒用麦芽糖浆复配使用，能够更适于啤酒的酿造。

1 材料与方法

1.1 材料

大豆蛋白，山东香驰豆业科技有限公司提供；木瓜蛋白酶（酶活力60万U/g），广州日日香酶制剂有限公司提供。

三氯乙酸、高岭土、浓硫酸、浓盐酸等试剂，均为分析纯；无水碳酸钠、邻苯二甲酸氢钾为基准纯；L-酪氨酸、甘氨酸、干酪素为生化试剂；丙烯酰氨、N,N'-甲叉双丙烯酰氨、三羟甲基氨基甲烷Tris、四甲基乙二胺TEMED、考马斯亮蓝R-250、十二烷基硫酸钠和电泳标准蛋白样品都为电泳纯。

根据待测蛋白质相对分子量的大小，选择相对分子质量在6 200～66 200 Da的Marker标准蛋白。

标准蛋白样品各组分成分见表1。

表1 标准蛋白样品各组分成分

1.2 仪器设备

PHS-3C型pH计、FA1004电子分析天平、KHW-D-1型电热恒温水浴涡、79-3型恒温磁力搅拌器、JJ-1型增力电动搅拌器、KDN-2C型凯氏定氮仪、KDN型消化炉、TDL-5-A型低速台式离心机、DYCG-30型电泳槽等。

1.3 大豆蛋白酶解液的制备

1.3.1 步骤

准确称量大豆蛋白，加入一定量蒸馏水，搅拌均匀，在80±2℃条件下处理15 min，冷却至预定温度后恒温水浴，调节pH值至设定值。加入一定量的酶粉（液），配制成设定底物质量分数的反应液，缓慢搅拌，反应过程用浓度为0.5 mol/L的NaOH溶液滴定维持体系在预定的pH值。反应到预定时间后，立即放入85℃或100℃水浴中加热15 min钝化蛋白酶，冷却后以转速4 800 r/min离心20 min，取上清液，置于冰箱冷藏。采用pH-state法测定大豆蛋白酶解过程的水解度[15]。

1.3.2 装置图

制备大豆蛋白酶解液的试验装置简图见图1。

1.4 测定方法

1.4.1 干固物[16]

1.4.2 蛋白质

参照GB 5009.5标准检测测定，换算系数为5.71。

1.4.3 可溶蛋白质回收率（NR）

大豆蛋白原料酶解后，称量酶解离心后上清液的质量，准确称取约1.000 g的蛋白酶解液，用凯氏定氮法消化、定氮，测定上清液中蛋白质含量，为：

1.4.4 α-氨基氮含量[17]

1.4.5 隆丁区分的测定[17]

1.4.6 SDS-PAGE凝胶电泳[18]

标准蛋白样和未知样品在同一块凝胶上进行电泳，用标准蛋白的迁移率与相对分子质量的对数作图，可以获得一条mR-lgMr标准曲线，根据未知蛋白的迁移率，可得到未知样品的相对分子质量。

2 结果与分析

2.1 酶用量对大豆蛋白水解产物的影响

底物质量分数6%，酶解温度60℃，pH值6.0，酶用量分别在6 000，8 000，10 000 U/g下进行酶解。随着酶解的进行，pH值逐渐下降，过程滴加浓度为0.5 mol/L的NaOH溶液保持pH值在6.0。取不同时间段的酶解液，测量其NR、DH，以及酶解液Lundin分布和电泳后的分子量分布。

酶用量对可溶蛋白回收率和水解度的影响见图2，酶用量对Lundin A、B和C区分分布的影响见图3，酶用量随反应时间变化所得酶解液的SDS-PAGE凝胶图谱见图4。

由图2可见，酶用量对NR、DH的影响很大。酶解初期DH增加很快，反应60～80 min后逐渐停滞，酶用量越高，快速酶解期越长，可达到的DH越大。酶解1～3 h，NR随酶解时间增长而增大，随后轻微变小，应该是酶解后期体系中小多肽数量浓度增大，自聚导致NR有所减小。

由图3可见，木瓜蛋白酶的单位用量远远大于Alcalase、Protamex 2种蛋白酶，但是对大豆蛋白的酶解效果不如它们，其A、B区分的含量比例在相同的水解时间下，较前2种的酶解液多，与酶的酶解特性有关。Alcalase为微生物来源的蛋白酶，其中含有碱肽酶，其酶解的特异性较宽，对蛋白质酶解效果往往优于植物来源的琉基蛋白酶——木瓜蛋白酶。随着酶用量和酶解时间的增加，A区分的含量比例迅速变少，然后逐渐变小；4～6 h时，此时A区分的含量都较为接近，约10%，属于较难于再被木瓜蛋白酶水解的高分子的部分。C区分在酶解2 h之后，其含量比例都超过60%，酶解6 h，甚至70%～80%。

2.4 疗效评估 患者应当在拔除尿管之后的4～6周复诊，以评价治疗反应和不良事件。如果患者的症状得以缓解且无不良事件，则没有必要进行进一步评估。在4～6周后随访时建议进行以下检测：IPSS、QOL、尿流率和残余尿测定。

随着酶用量和酶解时间的增加，B区分的含量变化显示一定的规律。酶用量6 000 U/g时，1～2 h阶段，B区分含量接近约23%，4 h时降至17.5%，6 h时又升高到19%，B区分保持相对高的含量。酶用量为8 000 U/g时，B区分的含量随酶解时间的增加总体呈下降趋势，但在2～4 h阶段，其B区分含量接近约13%，6 h时又下降到11%。酶用量为10 000 U/g时，B区分的含量随着酶解时间的增加也呈下降的趋势，但在4～6 h阶段，B区分的含量已经下降到趋于稳定，约为10.5%。

由图4可见，在反应1 h时，随着酶用量的增加，酶解液中的分子量分布，由6 000 U/g时分子量最大的接近43 000 Da，变为8 000 U/g时的31 000 Da左右。

酶用量为10 000 U/g时，与8 000 U/g时比较相近。当反应至2 h后，分子量约31 000 Da的蛋白质几乎不存在。由此可见，为了得到适合分子量分布的酶解液，同时考虑NR、DH等经济因素，选择酶用量为8 000 U/g较为适合。从B区分分布上也可见，在酶用量为8 000 U/g时，可以得到中分子量蛋白（12 000～40 000 Da） 含量在15%左右。

2.2 酶解pH值对大豆蛋白酶解产物的影响

底物质量分数6%，反应温度60℃，酶用量8 000 U/g，pH值分别在5.0，6.0，7.0下进行酶解，过程滴加浓度为0.5 mol/L的NaOH溶液保持pH值在6.0。取不同时间段的酶解液，测量其NR、DH，以及酶解液Lundin分布和电泳后的分子量分布。

酶解pH值对蛋白质回收率和水解度的影响见图5，酶解pH值对Lundin A、B和C区分分布的影响见图6，不同pH值条件下随反应时间所得的酶解液的SDS-PAGE电泳图谱见图7。

由图5可见，酶解pH值对NR影响较大。当pH值为6.0时，酶解液中的NR值最大，DH也相对

较高，pH值6.0为最佳的酶解pH值。与Alcalase，Protamex 2种蛋白酶的酶解相比，可能与木瓜蛋白酶 本身的酶解性质有关，其所得的NR、DH均较小，没有前面2种Alcalase，Protamex 2种蛋白酶的酶解效果那么好。

由图6可见，反应pH值为5.0时，A、B区分的含量随酶解时间的增长而呈下降趋势，C区分的含量则呈现增加的趋势，酶解1 h，C区分的含量已经接近60%。

反应pH值为6.0时，A、B区分的含量随酶解时间的增长，总体呈下降趋势。酶解4～6 h，A区分的含量接近，约8.5%；酶解2～4 h，B区分的含量接近，约14%；酶解1 h时，C区分的含量已经接近60%，之后逐渐增大。

反应为pH值7.0时，酶解4 h之时，其A区分的含量最小，为10.1%；酶解6h，A区分的含量反而升高到12.5%；在4～6 h的酶解阶段，C区分含量比较接近，B区分的含量则下降，可认为中分子的B区分在4～6 h的酶解阶段，应该有部分多肽重新聚集又转化成为了高分子的A区分的部分。

由图7可见，3个pH值条件下酶解所得的酶解液分子量分布的变化比较小，主要分子量分布在30 000，19 000，15 000，6 000 Da。综合图 5～ 图 7的结果，选取反应pH值为6.0。

2.3 温度对大豆蛋白酶解产物的影响

底物质量分数6%，酶用量8 000 U/g，pH值6.0，分别在55，60，65℃下对大豆蛋白酶解，过程滴加浓度为0.5 mol/L的NaOH溶液保持pH值在6.0。取不同时间段的酶解液，测量其NR、DH，以及酶解液Lundin分布和电泳后的分子量分布。

酶解温度对蛋白质回收率和水解度的影响见图8，温度对酶解液Lundin A、B和C区分分布的影响见图9，不同温度条件下随反应时间所得酶解液的SDS-PAGE电泳图谱见图10。

由图8可见，随反应时间的延长，温度对NR、DH的变化影响基本一致。酶解1～3 h，NR增大，随后NR下降。酶解初期（50～70 min之前），DH增长很快，80 min之后增加变缓。酶解温度为60℃时，在相同的反应时间时，其酶解液的NR、DH都为最大，酶解的效果最好。

由图9可见，反应温度对木瓜蛋白酶的酶解反应及其Lundin分布的影响较大。随着酶解反应的进行，基本呈现A、B区分的含量逐渐降低，C区分不断升高的趋势。酶解2 h后，C区分含量都在60%或60%以上，其中60℃的酶解温度，C区分的含量最大，表明60℃下木瓜蛋白酶的酶解效果较突出。

在65℃，1～6 h的阶段，其A区分的含量都比反应温度55，60℃的大，表明在65℃的酶解，酶活力降低，酶解大分子蛋白的能力较差。

比较关注的B区分，对55，65℃的酶解温度，在2～6 h阶段，B区分保持在15%左右；60℃的酶解温度，在2～4 h阶段，B区分接近15%。

由图10可见，当温度增至65℃，反应1 h时出现了分子量大于43 000 Da的大分子多肽，表明此时酶的活力较弱，酶解大分子蛋白的能力较差，与图9的Lundin分布图上A区的变化情况一致（65℃时，其A区分的含量最大）。由此可见，要得到A区分分布较高的酶解液，可以通过提高反应温度来实现，但是较高的反应温度会使得酶活力降低，使得NR、DH降低，综合B区分等因素，选择反应温度为 55～60 ℃。

2.4 底物质量分数对大豆蛋白酶解产物的影响

酶用量8 000 U/g，酶解温度60℃，pH值6.0，底物质量分数分别在4%，5%，6%，7%进行反应，过程滴加浓度为0.5 mol/L的NaOH溶液保持pH值6.0。取不同时间段的酶解液，测量其NR、DH，以及酶解液Lundin分布和电泳后的分子量分布。

底物质量分数对蛋白质回收率和水解度的影响见图11，不同底物质量分数下随反应时间所得的酶解液的SDS-PAGE电泳图谱见图12。

由图11可见，随着底物质量分数的提高，DH轻微地降低，较高底物质量分数使得酶解液黏度增大，影响木瓜蛋白酶扩散，降低水分活度，对酶解反应有抑制作用。随着底物质量分数的提高，NR先升高，到底物质量分数为6%之时，NR最大；7%时，NR又变小。酶解3 h之前，NR都随酶解的进行而不断升高，随后的3～6 h阶段，NR都逐渐轻微地降低。

由图12可见，底物质量分数对水解产物的分子量变化有一定的影响。7%的质量分数在水解初期，可见还存在分子量接近于43 000 Da的大分子多肽；酶解至2.5 h，就只存在分子量小于或等于20 100 Da的多肽组分了。4%的质量分数在酶解初期，还可见存在分子量接近于31 000 Da和大于20 100 Da的诸多的多肽谱带；酶解至2.5 h，就只存在分子量（远）小于20 100 Da的多肽组分了。

底物质量分数与酶用量、pH值、温度等试验的几个因素相比，属于较次要的影响因素。考虑NR和DH，底物质量分数为5%～6%比较适宜，为获得较高的原料利用率，选择6%。

3 结论

（1）为了得到可以与糖浆复配、用于部分或全部替代麦汁的酶解液，所选取的酶解条件并不是得到最佳水解度的酶解条件。当反应时间为1～2 h时，所得到的酶解液的Lundin分布较为接近麦汁Lundin区分分布的要求，此时的NR值为52.2%。

（2）木瓜蛋白酶制取含氮糖浆复配酶解液的最佳条件为酶解温度55～60℃，底物质量分数6%，酶用量8 000 U/g，pH值6.0，反应时间1～2 h，所得的酶解液为浅黄色，外观较好，与啤酒糖浆相容、易混，口味风味和谐，因此采用木瓜蛋白酶制取啤酒糖浆复配的蛋白氮源的酶解液是可行的。

（3） 试验发现，就单独使用Alcalase、Protamex和木瓜蛋白酶中的任何一种酶，发现在一定的酶用量、pH值、温度、底物质量分数和酶解时间下，所得到的大豆蛋白酶解液的Lundin分布，要与麦汁Lundin区分分布的A区分含量25%、B区分含量15%和C区分含量60%的要求相同，是很难或者不可能实现的，实际运用时也没有必要，接近或者相近即可。因此，采用单（蛋白） 酶在各自不同的条件下进行酶解，测定的酶解液的Lundin分布，依此计算，按一定的质量比例将其混合，得到的（混合的） 大豆酶解液，其Lundin分布更容易满足麦汁Lundin区分分布的A区分含量25%、B区分含量15%和C区分含量60%的要求，是今后研究工作的方向。比如，木瓜蛋白酶的酶解液虽然蛋白质回收率较低，但是其中高分子可溶性蛋白含量要比Alcalase、Protamex 2种酶的酶解所得酶解液中的高分子蛋白的含量多。因此，采用木瓜蛋白酶制取的蛋白酶解液，主要侧重于提高复配蛋白酶解液中高分子蛋白的含量。

（4） 对于Alcalase、Protamex和木瓜蛋白酶酶解的大豆蛋白酶解液，以及麦汁中的可溶蛋白质，虽然参考文献[17]的方法，按其溶解特性和分子量的大小，将其分为A、B和C的3种区分。但是，不同来源和酶解方法得到的样品或麦汁，可溶蛋白的A区分或B区分或C区分，只是代表这些多肽组分具有相同的化学溶液溶解特性，以及相同相近的范围分子量大小，它们各自的蛋白分子的化学结构是不同的。各个相同区分的多肽，对啤酒酵母来说，是分子量相同相近而化学结构不同的有机氮源的营养成分。因此，即使它们的Lundin区分分布都是A区分含量25%、B区分含量15%和C区分含量60%，但各自的使用效果和终端发酵产品品质，也一定会存在轻微的差异不同。①葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和低聚糖等糖类，已经比较清楚其在啤酒酿造过程的作用，以及对啤酒产品品质的影响，从而指导了啤酒用淀粉糖浆的开发、生产和应用。对于这些相同区分的不同化学结构和来源的大豆多肽，其对啤酒酿造和产品品质的影响机理及其结果，是一个值得深入研究的课题。②在①理论研究的基础上，对使用大豆或其他新的有机氮源进行替代或部分替代，用于啤酒或其他传统食品的发酵，这种差异不同也将孕育产生新的风味、口感和差异化产品的可能，也指导着课题下一阶段的工作研究重点。