复方黄槐灌肠剂质量标准

廖娴，王雅文，黄月纯，丘振文，蔡庆群

(1.广州中医药大学第一附属医院药学部，广州 510405；2.广州中医药大学第一临床医学院，广州 510006)

复方黄槐灌肠剂是广州中医药大学第一附属医院的院内制剂，由大黄、槐花、积雪草等中药组方制成，具有通腑降浊、清热解毒之功效，主要用于血症(呕血、吐血、便血及其他出血)，临床应用效果较好，受到患者欢迎。方中大黄具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄之功效[1]。大黄主要含有蒽醌类、蒽酮类、二苯乙烯类、苯丁酮类、鞣质类、多糖类物质等[2]。蒽醌类为大黄重要代表性成分，游离蒽醌是抗菌消炎的主要有效成分[3]。槐米和槐花中的黄酮类化合物有10余种，主要为槲皮素、山柰酚、染料木素、异鼠李素及其糖苷，其中芦丁是槐米中含量最高的黄酮苷成分[4-5]。目前，复方黄槐灌肠剂的检测标准缺乏相关的定性及定量指标。为发挥医院制剂特色，同时加强制剂质量控制，保证患者用药安全有效，笔者在本实验对复方黄槐灌肠剂方中主要药味大黄、槐花进行薄层色谱(TLC)定性研究，并采用高效液相色谱(HPLC)法测定大黄中蒽醌类成分含量，初步建立了专属性强、稳定可靠的质量控制方法。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent 1200 高效液相色谱仪(美国 Agilent 公司，DAD 检测器，Agilent 1200色谱工作站)；半自动点样仪(CAMAG Linomat-5)；全自动展开仪(CAMAG ADC2)；硅胶H预制板(青岛海洋化工厂，批号：20140512)；硅胶H自制板；硅胶G预制板(烟台市化学工业研究所，批号：20140319；青岛海洋化工厂，批号：20140108)；HWS24型电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)； XA105型十万分之一电子天平(METTLER TOLEDO公司，感量：0.01 mg)。

1.2试药 芦丁对照品(批号：100080-201408，含量：90.2%)、大黄对照药材(批号：120902-200408)、大黄酸对照品(批号：0757-200005，含量：100%)、芦荟大黄素对照品(批号：110795-200806，含量：98.6%)、大黄素对照品(批号：0756-200110，含量：100%)、大黄酚对照品(批号：0796-200208，含量：100%)、大黄素甲醚对照品(批号：110758-200610，含量：98.6%)均由中国食品药品检定研究院提供。大黄阴性对照样品(广州中医药大学第一附属医院制剂中心，按工艺制成不含大黄的样品)，槐花阴性对照样品(广州中医药大学第一附属医院制剂中心，按工艺制成不含槐花的样品)，复方黄槐灌肠剂(批号：20171201，20180501，20180801，广州中医药大学第一附属医院制剂中心提供)；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1TLC鉴别

2.1.1大黄的TLC鉴别 量取本品5 mL，加水至10 mL，加盐酸1 mL，加热回流30 min，立即冷却，用乙醚振摇提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加三氯甲烷1 mL使溶解，即得供试品溶液。取大黄阴性对照样品5 mL，按供试品方法制成大黄阴性对照溶液。另取大黄对照药材0.1 g，加甲醇20 mL，浸泡1 h，滤过，取滤液10 mL，蒸干，残渣加水10 mL使溶解，自“加盐酸1 mL”起，同法制成对照药材溶液。再取大黄酸对照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的对照品溶液。照TLC法(《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0502)实验，吸取上述4种溶液各4 μL，分别点于同一硅胶H薄层板上，以石油醚(30～60 ℃)-甲酸乙酯-甲酸(15：5：1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(波长365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱及对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点；置氨蒸气中熏后，斑点变为红色，大黄阴性对照溶液未见干扰，见图1。

2.1.2槐花的TLC鉴别 取本品10 mL，用乙醚振摇提取2次，每次20 mL，弃去乙醚液，水液用乙酸乙酯振摇提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取槐花阴性对照样品10 mL，按供试品方法制成槐花阴性对照溶液。另取芦丁对照品，加甲醇制成每毫升含2 mg溶液，作为对照品溶液。按照TLC法(《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0502)实验，吸取上述3种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水(8：1：1：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，待乙醇挥干后，105 ℃加热约5 min，置紫外光灯(波长365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，槐花阴性对照液未见干扰。见图2。

1.大黄酸对照品；2.大黄对照药材；3—5.供试品溶液；6.大黄阴性对照溶液。

图1 大黄TLC图

1.rhein reference；2.RadixetRhizomaRheiPalnatareference；3-5.samples；6.RadixetRhizomaRheiPalnatanegative control.

Fig.1 Thin layer chromatogram ofRadixetRhizomaRheiPalnata

1.芦丁对照品；2—4.供试品溶液；5.槐花阴性对照溶液。

图2 槐花TLC图

1.rutin reference ；2-4.samples；5.sophorareflos negative control.

Fig.2 Thin layer chromatogram ofSophorajaponica

2.2含量测定

2.2.1色谱条件 色谱柱为Agilent Zorbax SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.1%磷酸(85：15)；检测波长：254 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2.2对照品溶液的制备 精密称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，加甲醇制成每毫升含芦荟大黄素8.52 μg、大黄酸8.96 μg、大黄素8.34 μg、大黄酚8.40 μg、大黄素甲醚4.09 μg的混合对照品溶液。

2.2.3供试品溶液的制备 精密吸取本品1 mL，置圆底烧瓶，加8%盐酸10 mL，再加三氯甲烷20 mL，置水浴中加热回流1 h，立即冷却，转移至分液漏斗，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，水浴蒸干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10 mL量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得[6]。

2.2.4阴性样品溶液的制备 精密吸取缺大黄的阴性对照品，按“2.2.3”项供试品溶液制备方法制备大黄阴性样品溶液。

2.2.5专属性实验 分别吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各 10 μL注入液相色谱仪，按“2.2.1”项色谱条件测定，结果各峰分离良好，峰形对称，且阴性样品在相应位置无干扰峰，表明专属性良好，见图3。

2.2.6线性关系考察 精密称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，加甲醇制成每毫升含芦荟大黄素8.52 μg、大黄酸35.84 μg、大黄素8.34 μg、大黄酚14.62 μg、大黄素甲醚4.09 μg的混合对照品贮备溶液。

分别精密吸取混合对照品贮备溶液0.5，1，2，3，4 mL于10 mL 量瓶，分别加甲醇至刻度，精密吸取10 μL注入液相色谱仪，测定峰面积。按“2.2.1”项色谱条件进样分析，测定峰面积。以进样量(ng)为横坐标(X)，色谱峰面积(A)为纵坐标(Y)，进行线性回归，结果见表1。

2.2.7精密度实验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，按“2.2.1”项色谱条件，连续进样6次，记录峰面积。结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.73%，0.94%，0.62%，0.85%，1.02%(n=6)。结果表明仪器精密度良好。

2.2.8重复性实验 取同一批(批号：20180501)样品6份，分别按“2.2.3”项方法制备供试品溶液，进样分析，记录峰面积并计算样品含量。结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的平均含量分别为15.49，93.89，23.99，29.34，6.25 μg·mL-1，RSD分别为1.12%，1.53%，1.79%，2.01%，1.33%(n=6)。结果表明重复性良好。

2.2.9稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别于0，2，4，8，12，24 h后进样分析，记录峰面积，结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为1.01%，1.93%，1.85%，2.04%，1.73%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内较稳定。

A.大黄阴性样品溶液；B.混合对照品溶液；C.供试品溶液；1.芦荟大黄素；2.大黄酸；3.大黄素；4.大黄酚；5.大黄素甲醚。

图3 复方黄槐灌肠液HPLC图

A.RadixetRhizomaRheiPalnata negative sample solution；B.mixed sample solution；C.sample solution；1.aloe-emodin；2.rhein；3.emodin；4.chrysophanol；5.physcion.

Fig.3 HPLC chromatograms of compoundHuanghuaienema

表1 5种成分回归方程与线性范围

Tab.1 Regression equations and linear range of five components

成分回归方程相关系数(r)线性范围/ng芦荟大黄素Y=4.437 6X+0.092 10.999 94.26～34.08大黄酸Y=2.334 X+0.497 60.999 717.92～143.36大黄素Y=3.135 9X-0.392 70.999 84.17～33.36大黄酚Y=4.879 3X+1.334 50.999 87.31～58.48大黄素甲醚Y=3.381 4X-0.112 70.999 82.04～16.36

2.2.10回收率实验 取已知含量的同批样品(批号：20180501)6份，每份0.5 mL，精密量取，分别精密加入各对照品溶液适量，按照“2.2.3”项方法制备供试品溶液，并进样分析，计算加样回收率，结果见表2。

表2 5种成分加样回收率实验结果

Tab.2 Results of recovery test of five components

n=6

2.2.11样品测定 分别取各批号样品，按“2.2.3”项方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下测定，计算含量，结果见表3。

表3 5种成分3批样品的含量测定结果

Tab.3 Content determination result of 3 batches of 5 components

μg·mL-1，n=3

3 讨论

在TLC鉴别实验中，根据《中华人民共和国药典》2015年版一部大黄项下所收载薄层鉴别方法研究[1]，所得色谱斑点清晰，供试品色谱在与对照药材、对照品色谱相应的位置上斑点对应良好，且阴性对照无干扰，列入标准。参考《中华人民共和国药典》2015年版一部槐花项下薄层鉴别方法进行研究[4]。《中华人民共和国药典》2015年版槐花项下显色方法为喷1%三氯化铝乙醇溶液，挥去乙醇，置紫外光灯(波长365 nm)下检视，结果主斑点颜色较淡，供试品溶液需较浓或增加点样量斑点才较清晰。《中华人民共和国药典》2015年版含槐花的复方制剂显色方法有采用5%三氯化铝乙醇溶液或10%三氯化铝乙醇溶液，在放置过夜后检视或105 ℃加热显色后检视。笔者在本研究采用了5%三氯化铝乙醇溶液为显色剂，分别对喷显色剂后直接检视、放置1 h后检视、放置过夜后检视与105 ℃加热显色后检视，结果105 ℃加热显色后检视斑点最清晰。槐花薄层展开剂系统采用《中华人民共和国药典》2015年版槐花项下方法及含槐花制剂项下方法进行比较，确定采用槐花制剂项下方法。比较两种展开剂的薄层色谱图，《中华人民共和国药典》2015年版含槐花复方制剂项下乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水(8：1：1：1)为展开剂时，主成分斑点清晰，Rf值更适中，分离效果佳，方法简便，因此选择把该展开剂列入标准。

在含量测定研究中，确定了以大黄中的蒽醌类成分作为含量测定指标。在供试品溶液制备中，参考文献[6]用8%盐酸回流提取。流动相参考《中华人民共和国药典》2015年版大黄项下含量测定方法，选用甲醇-0.1%磷酸，发现分离效果良好，保留时间适宜，基线平稳，理论板数达到要求。

综上所述，笔者在本研究建立的复方黄槐灌肠液 TLC及 HPLC 测定法，经方法学验证，方法灵敏、快速，重复性好，达到制剂质量稳定可控的目的，可满足制剂安全有效的临床需求。