低浓度含油泥砂生物修复试验研究

杨 勇 ，肖成磊 ，郭 兵 ，杨 庭 ，王永林 ，王新新 ，白 鹤

（1.天津大学化工学院，天津 300072； 2.中海油能源发展股份有限公司安全环保分公司，天津 300457；3.中海石油环保服务（天津）有限公司，天津 300457）

0 引言

含油污泥是由水油、水油乳状液和悬浮固体组成的一种复杂的复合物，包含各种烷烃、芳香烃、NSO化合物等，属于危险固体废物[1-2]，直接排放会严重破坏生态环境[3]。含油污泥从来源上看，可分为原油开采、油田集输过程及炼油厂污水处理产生的含油污泥[4-5]。含油污泥组成各异，通常含油率在10%~50%之间，含水率在40%~90%之间[6-9]。含油污泥含有大量老化原油蜡质、沥青质、胶体、固体悬浮物、细菌、盐类、酸性气体、腐蚀产物等，还包括生产过程中投加的大量絮凝剂、缓蚀剂、阻垢剂、杀菌剂等水处理剂[10-11]。若不能有效处理，会对生态环境造成严重破坏。由于含油污泥黏度高、脱水难，处理起来相当困难，给油田企业废物处置带来了沉重的负担。

现有含油污泥的处理方式包括物理处理、化学处理和生物处理（生物修复）等[12－13]。相对于物理处理和化学处理，生物处理因具有成本低、效率高，不会造成土壤二次污染等特点而得到广泛应用[14-17]。富集后的降解菌可利用本土强化技术对污泥进行生物降解[18-19]。现有的研究一方面仅限于考察不同种类微生物去除石油烃污染物的机制，而未考察所培育的微生物的现场应用效果，因而难于在油泥砂修复过程获得应用；同时，现有的研究规模大都停留实验室模拟阶段，尚未见油泥砂修复的现场示范应用或大规模应用。因此，笔者根据油泥砂的特点，研究了现场应用修复作用，对改善和恢复生态环境质量具有重要的现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

蛋白胨、大豆蛋白胨（北京奥博星生物技术有限责任公司）；磷酸氢二钾、氯化钠、琼脂粉（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；葡萄糖、氢氧化钠、盐酸（天津市光复科技发展有限公司）；草酸铵结晶、碘-碘化钾、冰乙酸、氯化钠、乙酸钠（天津市北方天医化学试剂厂）；无水乙醇（天津市风船化学试剂科技有限公司）。

1.1.2 主要仪器与设备

PCR 仪（powercycle，德国耶拿分析仪器股份公司）；生化培养箱（LRH-150，上海一恒科学仪器有限公司）；高速离心机（H1650-W，湘仪动力测试仪器有限公司）；电子天平（ME204，梅特勒-托利多集团）；超净台（SW-CJ-2FD，苏州净化设备有限公司）；显微镜（E200，株式会社尼康）；紫外分光光度计（UV-1200，上海美普达仪器有限公司）；摇床（HNY-211B，天津市欧诺仪器仪表有限公司）； 立式压力蒸汽灭菌器（MLS-3750，上海一恒科学仪器有限公司）；旋涡混合仪（XW-80A，海门市其林贝爾仪器制造有限公司）；恒温冰箱（BCD-539WL，青岛海尔股份有限公司）。

1.1.3 培养基

BH（1 L）：NH4NO31 g；NaCl 1 g；KH2PO41 g；K2HPO41 g；MgSO4·7H2O 0.2 g；CaCl20.02 g；FeCl3（或 FeSO4）0.05 g，（pH 值 =7.2）。

石油降解培养基： 向BH 培养基中加入1%的原油，即100 mL BH 培养液中加1 g 原油。

1.2 方法

1.2.1 菌株筛选与驯化

采集矿井周围有明显溢油的石油污染土壤，采样点6 处，采集土样约100 g，用封口袋封装留存；以石油为单一碳源，250 mL 摇瓶在 30 ℃，220 r/min 驯化培养石油污染处采集样品；驯化约1 周后，弃上清液加经高温灭菌的加1%原油的BH 培养基100 mL，继续在 30 ℃，220 r/min 下 250 mL 摇瓶培养；重复2~3 次；取转接后经降解的菌液1 mL 于1.5 mL移液管中，以十倍稀释法稀释成10-5，10-6，10-7，10-8，10-9 待用； 将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基放入水浴中加热至融化，待冷却至50 ℃左右，倒平板（每个皿约15 mL)，平置，待凝固；将经灭菌的培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用移液器吸取0.1 mL 菌液对应接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号设3 个重复）；平板划线法得单一菌落；恒温培养，并观察菌株形态，留图保存，每菌预存斜面及甘油管各2 支。

1.2.2 降解率的估测

取250 mL 锥形瓶，称取原油重量为1 g。重复操作约 50 次。配置 BH 培养液约 5 L，分装 100 mL 于 250 mL 锥形瓶，得到含油质量分数1%的油瓶；取对数期单菌母液3 mL，9 000 转离心5 min，倒掉上清液，洗涤2~3 次后，用 3 mL 双蒸水悬浮，接种 1 mL 至 50 mL 石油降解培养基，做3 个平行；将摇瓶在37 ℃，220 r/min转速下培养菌株7 d，待油瓶适度降解后，停止培养并取样测试；用正己烷萃取菌株降油后的培养液，留上层清液，放置待挥发后测定残余油的质量（m，单位g）。降解率的估算：菌株的降解率 = （1-m）/1。

1.2.3 气质分析（GC-MS）

选用正己烷，将萃取液做适当稀释，稀释倍数为1 000 倍的体积比，将1 μL 样品注入进样口进行气相色谱质谱联用分析。气质方法：气相色谱质谱联用分析仪（Agilent 6890），HP-5MS 毛细管柱（最大承受温度：325 ℃，行程长度：30.0 m，标称内径：250.0 μm，标准膜厚度：0.25 μm，初始流速：1.0 mL/min，额定初始压力：52.61 kPa，平均流速：36 cm/s），利用氮气作为载气，载气的流速是35.0 mL/min。初始柱温设置为50 ℃，保持0.5 min后以10 ℃/min 的速度加温到310 ℃。

1.2.4 油泥砂生物修复无害化处理小试

综合应用单因素实验法和响应面实验法，确定优化菌株的发酵条件和磁絮凝条件。将菌体悬液分别与硅藻土、锯末、秸秆、花生壳和活性炭等5 种吸附材料按1 ∶10 的比例混合均匀，放置10 d 后，稀释平板涂布法进行菌落计数，考察吸附材料对石油烃降解菌的吸附能力。采用生物修复方法，物料组成见表1。

表1 油泥砂生物修复物料比例

按表1 的比例将洗脱后的油泥砂与秸秆、有机肥、石油烃降解菌剂进行充分混合、堆制，调节含水量至30%。定时取样分析，监测其含油量等参数变化。为了进一步检验生物修复后的残渣的残留毒性，开展植物试验。选取生长快速，易于栽培且环境友好的黑麦草和苜蓿作为实验对象[20]，分别用处理前的含油泥砂、生物修复后的含油泥砂和健康土壤种植黑麦草和苜蓿2 种植物，观察记录植物生长状况。

1.2.5 油泥砂生物修复无害化处理中试

建立150 m3油泥砂生物修复示范工程，该工程建立3 个生物堆，每堆50 m3油泥砂。为了获得理想的处理效果，建立堆肥大棚，控制堆肥过程的温度和释放的VOC。测定含油量等参数。DGGE 用于分析自然环境中微生物群落变化。实验过程中样品采用MOBIO 公司的土壤基因组试剂盒PowerSoilRDNA Isolation Kit 进行基因组DNA 的提取，先用琼脂糖凝胶电泳检测，之后进行PCR 扩增，引物采用富含GC夹子的 338F 与 518R，酶使用 TransFastRTaq DNA Polymerase，放于4 ℃保存备用。分别配置体积比为0%和80%的变性母液储存，调配相应梯度浓度的凝胶，确定合适的变性剂范围为30%~60%。灌胶，而后放入40 ℃烘箱中约30 min。150 V 电压下，电泳7 h后取出胶块，EB 染色30 min，使用Tanon-1600 凝胶成像仪进行成像分析，使用Tanon Gis 软件对DGGE图谱进行凝胶图谱分析。

2 结果与讨论

2.1 石油烃降解菌分析结果

石油降解菌分析结果见表2。

表2 石油降解菌分析结果

2.2 油泥砂生物修复无害化小试、中试处理结果

2.2.1 含油量、重金属等指标测定

油泥砂生物修复无害化小试处理后，含油烃含量显著降低，见图1。经过12 个月的生物修复，含油质量比降至3 000 mg/kg 以下，经过24 个月的生物修复，含油质量比降至2 000 mg/kg 以下。对含水率、pH值、砷、镉、铬、铜、镍、铅、锌、汞等指标进行汇总，见表3。通过分析上述指标发现：油泥砂生物修复后满足GB/T 23485—2009《城镇污水处理厂污泥处置-混合填埋泥质》标准。

图1 油泥砂生物修复无害化处理含油量变化小试

油泥砂生物修复无害化中试处理后，含油量显著降低，见图2。经过130 d 的生物修复，含油质量比降至 3 000 mg/kg 以下，对含水率、pH 值、砷、镉、铬、铜、镍、铅、锌、汞等指标进行汇总，见表3。通过分析上述指标发现： 油泥砂生物修复后满足GB/T 23485—2009《城镇污水处理厂污泥处置-混合填埋泥质》标准。

图2 油泥砂生物修复无害化处理的含油量变化中试

表3 油泥砂生物修复后各指标测试结果

2.2.2 植物试验结果

黑麦草和苜蓿在处理前的含油泥砂上不能生长，但是在生物修复后的含油泥砂上生长旺盛。尽管部分指标与健康土壤有一定差距，但是生物修复后的含油泥砂中的黑麦草的根长和茎长这2 项指标明显高于健康土壤，苜蓿的茎重和根长这2 项指标明显高于健康土壤。这说明生物修复后的含油泥砂毒性已大大降低，适合植物生长。油泥砂生物修复后植物生长情况见表4。

表4 油泥砂生物修复后植物生长情况

2.2.3 微生物群落变化

油泥砂生物修复无害化后的微生物群落变化、条带回收二次DGGE 电泳图谱、菌落PCR 的结果见图3。从测序结果可以看出，菌落的种类主要集中在Alcanivorax，Pseudomonas，Marinobacter3 个属，这 3 个属的微生物均对石油烃有较好的降解效果，是土壤和水体等环境中关键的石油降解菌。油泥砂生物修复过程中出现了这些菌，说明修复过程中出现了大量的石油降解菌，进一步印证了油泥砂的生物降解。

图3 微生物群落变化、条带回收二次DGGE 电泳图谱和菌落PCR 结果

2.2.4 渗滤液分析

生物处理后油泥砂的最终处理有填埋和作为绿植土2 种方式。目前，填埋是主要的处理方式。渗滤液是目前影响填埋的关键因素，为探讨填埋的可行性，对生物处理后油泥砂的渗滤液进行分析。对生物处理后油泥砂进行取样，按USEPA Method 5030 进行前处理, 根据 US EPA Method 8260C 用 GC/MS 仪分析, 根据NIST 谱库对检测出的主要化合物进行定性检索，并以内标1,4-Dichlorobenzene-d4 为参考物进行半定量。堆肥渗滤液GC/MS 分析图谱见图4。

图4 堆肥渗滤液GC/MS 分析图谱

分析并未发现支链烷烃、直链烷烃、多环芳烃等油泥砂中的典型组分，从侧面印证了生物处理降解了油泥砂中的石油烃。堆肥渗滤液中仅发现了低浓度的二氯甲烷、三氯甲烷、溴二氯甲烷等物质。油泥砂生物处理后的渗滤液中二氯甲烷质量浓度仅为6.7 μg/L，远远低于日本渗滤液排放控制标准规定二氯甲烷的0.2 mg/L，满足该项的规定。

3 结论

从含油泥砂中分离筛选2 株石油烃降解菌，研究菌株对含油泥砂的降解能力及生物修复效果。

（1）综合应用单因素实验法和响应面实验法，确定优化了菌株W25 和W33 的发酵条件和磁絮凝条件。实验室小试结果表明：油泥砂生物修复无害化处理后，含油量显著降低。经过12 个月的生物修复，含油质量比降至3 000 mg/kg 以下，经过24 个月的生物修复，含油质量比降至2 000 mg/kg 以下，含水率、pH值、砷、镉、铬、铜、镍、铅、锌、汞等指标均达到GB/T 23485—2009 《城镇污水处理厂污泥处置-混合填埋泥质》标准要求。

（2）通过植物试验检验生物修复后残渣的残留毒性。分别对生物修复前、生物修复后的含油泥砂和健康土壤种植黑麦草和苜蓿2 种植物，观察记录植物生长状况，结果表明：生物修复后的含油泥砂毒性已大大降低，适合植物生长。

（3）为进一步推进油泥沙生物修复的工程化应用，建立了150 m3油泥砂生物修复示范工程，经过130 d 的生物修复，含油质量比降至3 000 mg/kg 以下，含水率、pH 值、砷、镉、铬、铜、镍、铅、锌、汞等指标均达到GB/T 23485—2009 《城镇污水处理厂污泥处置-混合填埋泥质》标准要求，在修复过程中出现了大量的石油降解菌，进一步印证了含油泥砂的生物降解。对生物处理后油泥砂的渗滤液分析表明：渗滤液中二氯甲烷质量浓度仅为6.7 μg/L，远远低于日本渗滤液排放控制标准规定二氯甲烷0.2 mg/L，满足该项的规定。