梨果实香气物质的研究综述

张 军，李靖靖

(郑州工程技术学院 化工食品学院，河南 郑州 450044)

梨是人们最喜爱的水果之一，其独特的香气是构成梨品质的重要因素。作为世界四大水果之一，全世界有 88 个国家和地区生产梨[1]。栽培品种分为东方梨或亚洲梨和西洋梨两大类[2]。据美国农业部海外农业服务局提供的数据显示，2017年全球鲜食梨产量达到2530万t，中国梨产量达到1930万t[3]。随着产品的大量供给和人们需求价值的提高，对品质追求从外观、口感等转向内在的、隐性的品质，消费者愈发重视果实的香气品质。因此，果实香气品质成为近年来水果产业的重要的热点研究领域之一。

1 梨果实香气的研究思路和态势分析

果实的香气是评价果实品质的重要指标之一。近年来，对水果(蔬菜)香气品质的研究受到国内外学者的广泛关注。水果(蔬菜)的挥发性气味被人们称作芳香性气味，也称之为果实的香气。评价果实品质的主要指标通常有个头大小、表面完好程度、颜色、耐贮性等，而对果实香气品质评价却一直没有确定的、明晰的评定方法。

早在1927年，Harley和Fisher 通过热崩解有机化学物质的方法(逆向假定)研究发现Bartlett梨挥发性气体中含有乙醛，拉开了人们研究梨果实香气成分的序幕。随后的1938年，Tindale 等发现Bartlett梨挥发性气体中除了含有乙醛外还有乙醇，并随着贮藏时间而变化。1952 年，英国科学家Martin 和 James 发表用气相色谱分离低碳数脂肪酸、挥发性胺等的方法，这标志着气相色谱法正式进入历史舞台。1955年第一台商品气相色谱仪的推出[4]是科学家研究痕量气体的里程碑事件，从此人们对果实挥发性气体(香气)的研究进入了一个崭新时代——从模糊假定推测到精确定性定量。1956年，Mehlitz 和 Matzik 使用气相色谱法研究了不包括Bartlett梨在内的其他几种梨果实中挥发性酸和酯的含量，Jennings W在1961年使用同样的方法再次研究了Bartlett梨，定性定量了大量的酯等成分。由于气相色谱的使用，在1962年Drawert研究了梨果实中甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇、异丁醇、正丁醇、正戊醇、2-甲基丙醇、甲基丁醇、正己醇酯等等。1970年， Nursten 证明了癸二烯酸酯是Bartlett梨的特征香气成分或定义为“赋予食品独特香气的化合物”。自此，对于果实香气的研究由定性定量进入了特征成分确定阶段。自1990年Paillard 发表了关于苹果、梨、榅桲的风味的文章后，对于西洋梨和东方梨的香气研究越来越多。虽然已有50多个栽培品种梨属植物，已鉴定出300多种化合物，包括烃类、醛类、醇类、酯类、酮类和含硫化合物等，但是相对于苹果、桃、草莓、香蕉，梨果实香气的研究仍然较少。

随着基因组学和代谢组学等理论的发展以及GC-MSMS等超痕量检测技术的应用，结合QTLs 分析技术、基因芯片和 RNA seq 等信息处理高新技术的广泛应用，香气物质代谢过程中的关键酶及调控因子不断得到明确，克隆和分离果实香气的相关基因不断取得相应成果。常见诸报端的研究有苹果、草莓、番茄等，而鲜有对梨果实香气的代谢研究。1975年Strandjev研究了东方梨，1990年Haruyasu研究了西洋梨在成熟及其贮藏过程中香气的动态变化，开始了梨果实香气的动态研究。1998年美国芝加哥大学Natilia Dudareva成功克隆了仙女扇花香气的BEAT基因；1999年Christian Chervin研究了梨成熟过程中乙醇脱氢酶基因表达和乙醇产生的关系，发现乙醇脱氢酶(ADH酶)是果实香气合成过程中重要的酶。从此，对果实香气的探索进入到生化及分子层面。

我国对果实香气的研究相对较晚，1991年张富春[5]研究了猕猴桃的香气成分是果实香气研究的起点；1992年梁莲莉[6]开始对蔷薇科刺梨果实香气进行研究。从此，有多人对各种梨的香气进行了定性定量分析。2014年，廖凤玲[7]开始研究梨香气的生理机制，巴金磊[8]研究了梨果实香气的α-法尼烯基因，Li G等[9]研究酯类与香气相关基因；2016年，Wei S等[10]通过转录组揭示了与香气代谢和释放相关基因；2017年，王龙[11]研究了梨果实在冷藏条件下酯类香气物质代谢途径关键酶活性及蛋白表达水平的变化。1992—2017年，国内科学家用25年的时间完成了欧美等国对梨果实香气90年(1927—2017年)的研究历程。

使用Web of Science选择所有数据库，检索关键词“pear & aroma”，得到174篇国内外对梨果实香气的研究结果，其中研究论文占170篇。使用中文知网检索关键词“梨and香气”，共有学术论文390篇，主要集中在2010年以后。综上，国内外科学家对于果实香气的研究按照香气成分定性定量、果实特征香气的确定、香气成分的前体物质、代谢机制及分子机理这一路线实现。

2 梨果实香气的成分及其研究方法

目前，已经鉴定出不同品种梨果实中300多种香气化合物，按香气化合物的结构特点可以分为酯类、醛类、醇类、酮类、酸类等五类挥发性物质。不同的果实品种中这些挥发性化合物的种类和比例各不相同，构成了果实特有的香气特征。有研究认为，酯类是西洋梨特征水果味或闻起来香甜的香气挥发性成分[12]，构成西洋梨果实特征香气成分是己醛、己酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸己酯、乙酸己酯、丙酸乙酯等[13]，其中辛酸乙酯给予梨果实有甜蜜的嗅感。李国鹏[14]等认为东方梨香气成分主要有丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸己酯、己醛、己烯醛、α-法尼稀等。

对于含量微小的果实香气的鉴定是随着高精密仪器的发展而被确认的。随着GC-MS等精密仪器的出现，香气成分的研究也更加深入广泛，而对于香气成分的采集(萃取)或香气分析的前处理方法成为决定该项研究的关键步骤。通常，对于气态挥发性化合物的富集一般有以下几种方法：

(1)同时蒸馏萃取法(SDE)。利用挥发性气体样品(蒸汽)和萃取剂蒸汽在密闭的装置中充分混合，组分在低于各自沸点时被蒸馏出来，样品挥发性成分首先被蒸馏出来，然后和萃取剂在冷凝管中完成萃取分离。SDE法的优点是将样品和溶剂萃取两步过程合二为一，与传统的水蒸气蒸馏方法相比，减少了实验步骤，节约了大量溶剂，同时也降低了样品在转移过程中的损失。在挥发性气体研究方面一直被人们使用，如张凤芳等[15]使用SDE提取葱的挥发性成分，Hong J H等[16]对柑橘香气进行研究。对梨果实香气的应用也多有报道，如使用SDE前处理结合GC-MS研究东方梨的香气、结合GC-MS研究La France pear成熟时的香气成分，等等。

(2)超临界萃取法(SFE)。以二氧化碳等气体为萃取载体，因其安全、性质稳定，常用于食品的分析[17]。果实的挥发性香气多部分是非极性的小分子化合物，二氧化碳是其优良的溶剂，对果实香气的研究也常见于报道，如Stefano等[18]对草莓的香气进行分析，Lacassie等[19]使用SFE萃取技术用GC-MS分析了梨等果实的香气，娄在祥等[20]研究了库尔勒香梨的香气精油成分。

(3)固相微萃取法(SPME)。该法是应现代仪器的要求而产生的样品前处理新技术，集采样、萃取、浓缩、进样于一体，真正实现样品的现场采集和萃取。设备小巧，携带方便，能够与各种色谱及色质等精密分析仪器联用。1989年加拿大Waterloo大学的科学家Pawliszyn提出了该新型样品前处理技术原理，1993年美国Supelco公司取得专利并商品化，且于1994年获美国匹兹堡分析仪器会议革新大奖，该技术在近十几年内受到了广泛的关注。该方法的基本原理是将各种样品中挥发性化合物直接吸附到一根带有吸附剂涂层的熔融石英纤维上，依照“相似相溶”原理对有机物进行吸附，从样品中将组分萃取出来，逐渐富集，然后解吸分析物至相连接的分析检测设备。固相微萃取的核心是萃取装置石英纤维上的吸附剂涂层，目前有两类：一类是均相聚合物涂层，如聚二甲基硅氧烷(PDMS)和聚丙烯酸酯(PA)，其中PDMS是一种高黏度橡胶状液体，PA涂层呈固态水晶状，在解析温度下可转变为液态，二者均属高黏性液相涂层，作用是吸收萃取待测物；另一类是多相多孔聚合物涂层，如聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)、聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯/碳分子筛(PDMS/DVB/CAR)等，这一类为固相涂层，作用是以吸附机理进行萃取[21]。该技术设备装置结构简单，小巧紧凑，形状像一只医用注射器，由手柄和萃取头两部分构成。萃取头顶端涂有不同类型吸附剂的熔融石英纤维头，用于萃取、吸附样品，手柄用于安装或固定萃取头，可永久使用。随着萃取吸附剂材质的改进，新型涂层不断被发明和应用， SPME 技术越来越广泛地应用于环境、食品、医药化工等多个领域。对于果实香气(挥发性气体)的研究比较多，Giannetti等[22]对苹果香气进行研究，Cuevas等[23]研究鲜橙的香气成分，张涵等[24]研究对比了我国常见的4 种主栽柑橘类香气，周立华等[25]研究了7 种小浆果香气成分等等。对于梨香气的研究主要出现在1995以后，如Suwanagul研究了4种西洋梨的香气成分，Zlati等[26]研究了Bartlett在不同阶段的香气问题，Chen等[27]研究了鸭梨的香气，Li G[28]研究了11种东方梨的香气，Wei S等[29]使用SPME研究了南果梨的香气变化。

3 梨果实香气代谢的生化机制

果实香气来源于果实的次级代谢，次级代谢依赖主代谢正常进行。参与主代谢的化学物质，也即香气成分的前体物质，由于参与生物代谢反应不同，产生香气(挥发性)小分子化合物的途径也不一样。按照前体物质的类型，可将香气代谢合成的途径分为脂肪酸代谢途径、氨基酸代谢途径和糖类代谢途径(单糖)等，其中起决定作用的酶类主要有脂氧合酶(LOX)、醇脱氢酶(ADH)、醇酰基转移酶(AAT)、β-葡萄糖苷酶(CB)。随着果实所处的发育阶段的不同，相关酶类活性也不同，从而产生不同的果实香气物质。在不同的阶段酶的活性受相关酶基因的调控，如LOX基因家族对果实香气成分中的酯类的调节，等等。

3.1 脂肪酸代谢途径

果实香气的主要成分是酯类、醇和醛类，这些物质的前体物质大多来自脂肪酸的转化，这一类香气产生的路径叫作脂肪酸路径。在果实香气合成过程中的脂肪酸路径有三种类型：α-氧化、β-氧化和脂氧合酶(LOX)途径，以β-氧化和LOX 途径为主。LOX 途径在很多果实的香气物质代谢中都得到了验证，如苹果、甜瓜、桃、梨等[30-33]。LOX 途径至少有脂氧合酶(LOX)、氢过氧化物裂解酶(HPL)和乙醇脱氢酶(ADH)参与反应，其中脂氧合酶是 LOX 途径中的第一步反应关键酶，决定反应的进行。在反应起始它识别不饱和脂肪酸的“二烯”结构并使其氧化形成过氧羟基脂肪酸，根据其加氧位点不同把LOX酶分成9-LOX和13-LOX两种类型。LOX基因已从许多植物中分离和鉴定，在果实发育成熟过程中，LOX基因家族差异调节香气的代谢，如苹果、梨果实香气的作用等。脂肪酸代谢途径如图1。

图1 脂肪酸产生香气的路径

3.2 氨基酸代谢途径

果实组织中含有的氨基酸在酶的作用下转变为挥发性的有支链脂肪族醇、醛、酮和短链酯类物质[34]，果实香气的这一来源被称为氨基酸代谢路径。氨基酸路径有两个支路：一条途径是在脱羧酶作用下生成醛，然后在醇脱氢酶(ADH)的作用下生成醇，接着参与或者不参与酯的合成；另一条途径是氨基转移酶的作用下生成α-酮酸，α-酮酸与辅酶A(CoAs)生成酰基CoAs，然后在醇酰基转移酶(AAT)作用下生成酯[35]。参与香气合成的氨基酸主要有缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸和苯丙氨酸等，其中缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和丙氨酸为甲基支链酯合成的前体物质。在一些果实中已经得到证实，如草莓、甜瓜、梨，等等[36-38]。氨基酸产生香气的路径如图2。

图2 氨基酸产生香气的路径

3.3 糖类代谢途径

果实中含有丰富的糖，其中单糖、双糖和一些糖醇不但是果实风味的来源，同时也是果实香气的重要前体物质。糖的本质是多羟醛或多羟酮，这些小分子糖经EMP途径(Embden Meyerhof Parnas pathway)无氧条件下经糖激酶分解成丙酮酸，再在丙酮酸脱氢酶复合体(pyruvate dehydrogenasecomplex)的催化下进行氧化脱羧反应生成乙酰辅酶A。乙酰辅酶A有两条途径合成酯：一是在醇转酯酰酶(AAT)催化下生成乙酸某酯；另一个是在还原酶催化下先生成乙醇，再合成某酸乙酯，具体如图3所示。

图3 碳水化合物产生香气的路径(单糖)

4 展望

果实香气是反应果实品质的重要指标。在物质生活日益丰富的今天，人们对品质的追求趋向完美，对消费水果(食品)追求趋向决定了水果产业的发展方向。因而，果实香气成了近年来研究的热点。从目前已发表的研究成果来看，果实香气相关研究主要集中在香气的种类和品种间果实香气的差异，果实特征性香气的确定，主要类别的香气物质代谢途径，果实成熟及其货架期、贮藏期果实香气成分及相关酶活性的变化等方面，而在如何通过传统的田间管理等人为手段精准地干预果实主代谢，进而影响次代谢的香气合成和释放，以及利用遗传工程、基因操作技术来改善果实的香气成分，调控果实香气的代谢，从而达到提高果实品质等方面研究较少。随着基因工程技术的快速发展和分子育种等理论的不断完善，利用分子生物学技术手段，了解果实香气代谢基因的信息，研究阐明果实香气代谢的关键酶基因的功能，达到对果实香气代谢的精准调控，是研究果实香气的必然趋势。

随着梨果产业的发展，梨品质提升日益凸显，特别是在果实香气方面尤显突出。本文分析总结国内外梨果实香气研究的特点，以期给我国梨产业发展中出现的香气问题提供一定的线索和启示。