单纯疱疹病毒复制机制的研究进展

胡雅涵　匡琳

摘 要 单纯疱疹病毒（herpes simplex viruses， HSV）是导致机体感染的常见病原体，一旦侵入人体并终身潜伏，当机体免疫力下降时，迅速复制引起临床症状。探明其复制机理尤为重要。本文就单纯疱疹病毒的复制机制，及主要参与影响转录合成的产物进行综述。

关键词 单纯疱疹病毒 病毒复制 病毒蛋白 综述

中图分类号：R730文献标识码：A

单纯疱疹病毒（herpes simplex viruses， HSV）是感染人体的一种常见病原体，为线性双链DNA病毒，有囊膜，属于疱疹病毒科 亚科的病毒。根据病毒血清型的不同，将其分为Ⅰ型和Ⅱ型单纯疱疹病毒，引起口腔和生殖器的损伤。HSV主要通过接触感染，在人体内可表现为两种感染形式：溶细胞裂解和潜伏感染。在上皮细胞中HSV进行裂解复制，而在感觉神经元中病毒则进入潜伏期，当受到外界刺激，免疫抑制及劳累时，病毒就能重新激活，引起临床症状。这两种状态在一定条件下反复交替出现，是HSV感染患者复发的原因。

HSV的增殖复制主要与病毒自身的调节蛋白和特定的细胞内分子彼此之间互相作用有关，是由其而引发的一系列转录事件，然而，对于病毒是如何在潜伏状态下参与转录和复制的过程并不是很清楚。而单纯疱疹病毒的复制与其他DNA双链相比，涉及其过程的基因产物多达至少84种，较为复杂，所以了解它的复制过程尤为重要。

1 HSV的基因结构

HSV为疱疹病毒家族的一部分，也具有疱疹病毒共有的结构，由内向外依次为病毒核心、衣壳、内膜和囊膜。HSV-1的基因组结构是由两个相对独立的长片段（UL）、短片段（US）和包绕在两端的反转重复序列构成。见图1。由于反转序列重组方式的差异，存在4种同分异构体，且一般同时存在。病毒DNA有环形、线形两种存在形式。在HSV的DNA进入感染细胞核内后，立即进行环化。

其病毒结构是由大量不同的蛋白整合而成的，分为衣壳（Capsid）、皮层（Tegument）、囊膜（Envelop），囊膜上存在有许多突起（Spike），见图2。病毒糖蛋白存在于囊膜中的突起上，结构蛋白（Virus Protein，VP蛋白）基本存在于衣壳与皮层中。

HSV基因根据转录激活的时间先后顺序分为即刻早期基因（Immediate Early Genes，IE or）、早期基因（ Early Gene，E or）、晚期基因（ Late Gene，L or）三类。其中 或立早基因的表达与病毒基因的表达相关，调控病毒复制; 或早期基因的表达涉及到病毒DNA的复制，合成和包装;晚期基因表达为合成病毒结构蛋白。在潜伏期感染时，病毒不复制，大部分基因的转录也被抑制，潜伏性相关转录本（Latency Associated transcript，LAT）是唯一大量表达的基因。

在涉及单纯疱疹病毒复制的84个已知的多肽中，至少有47个不需要病毒在培养细胞中复制，这些基因在最终分化的细胞中没有表达;另一些基因则改变细胞代谢以确保高的病毒产量，缺乏这些基因的变异病毒在自然界中无法生存。

2 HSV的复制机制

HSV与其他病毒的复制过程相同，分为吸附、穿入、生物合成、组装、释放。

2.1吸附与穿入

目前发现HSV侵入细胞的方式有两种。一种是通过受体途径，病毒通过糖蛋白与宿主细胞表面的特异性受体识别并结合，囊膜与细胞膜融合，病毒被包裹进入细胞。这是HSV进入细胞的主要经典途径，首先需要gB和gC对位于细胞膜上的糖胺聚糖（glycosaminoglycan）进行识别并结合，由其是在其表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（heparan sulfate proteoglycan，HSPG），使病毒吸附在細胞膜表面。病毒完成进入细胞的过程需要病毒囊膜上的gD、gB与异质二聚体gH /gL四种糖蛋白共同作用，gD糖蛋白与细胞表面的受体黏连蛋白1/2（Nectin1/2）、疱疹病毒进入中介蛋白（Herpesvirus entry mediator，HVEM）、3-O硫酸乙酰肝素（3-O- sulfated heparansulfate，3-OH-HS）结合后，发生构象的改变，促进gB与gH-gL二聚体相互作用，使囊膜与细胞膜融合。另一种方式是通过吞噬作用使病毒进入细胞。

在其融合过程中，有研究还提示gM，gK，UL11，UL20等也参与了细胞的融合过程。通过相互免疫共沉淀实验和谷胱甘肽S-转移酶（GST）下拉实验，证实了gk与UL20之间的直接蛋白相互作用。两者协同在细胞表面表达病毒诱导的细胞融合。实验表明缺乏gM或UL 11的突变病毒进入Vero细胞的动力学比亲本病毒慢，说明gM和UL 11在病毒诱导的细胞融合和病毒进入过程中都参与了膜融合现象。

糖蛋白在此过程中不可或缺，介导HSV附着和渗透到细胞中，并引发宿主免疫反应。目前已有12种已知的病毒糖蛋白（B-N）。这些糖蛋白与病毒吸附、入侵细胞、出芽、细胞-细胞间扩散及免疫逃逸等相关。gB介导融合、穿入和胞间扩散，并引发病毒的循环复制;gC参与吸附并介导感染与免疫逃避;gD参与病毒复制和刺激中和抗体的产生;gE/gI复合物参与并介导了HSV在细胞和传导通路中的胞间扩散;gG介导在CNS中，病毒的复制过程;gH/gL复合物在病毒感染中是不可或缺的成分，在宿主的免疫反应中是主要抗原，能使吸附稳定，诱导融合;gK在病毒复制中发挥着极为重大的作用，同时参与细胞内病毒的包膜合成，转运及释放。gM/gN均在病毒复制的过程中，都不是必要的，但在缺少时，会导致病毒的穿膜速度减慢。见表3。

2.2脱壳

在病毒进入宿主细胞后，囊膜脱去，皮层和核衣壳释放到细胞质，病毒核心沿着细胞的微管网络被转移到细胞核中，大部分的病毒蛋白会从衣壳中分离，而UL 36和UL 37仍与传入的HSV-1衣壳相关，并有助于衣壳向核内转运，之后，病毒DNA将通过核孔注入细胞核。VP1-2是UL36基因编码的最大的外壳蛋白，表达为 （晚期）基因，使蛋白水解裂解，从而让HSV-1 DNA释放进入细胞核。

在运输过程中，有两种蛋白起着关键的作用：VP16和病毒宿主关闭蛋白（Vhs），分别起着激活病毒基因表达和降解宿主细胞的mRNA的作用。VP16为UL48基因表达的病毒间层蛋白，能与病毒 基因结合使基因开始表达。当HSV侵入细胞，脱掉外层的核壳体后，VP16与宿主细胞因子Oct-1和HCF-1结合，形成诱导复合物，并与病毒 基因的转录激活元件TAATGA-RATTC结合，从而启动基因表达。并且，VP16转录激活域有多重作用，首先它能与基本转录因子和 基因启动子的辅激活物相互作用，调节组蛋白3（H3）的甲基化和去甲基化过程，并且还能通过与HAT作用，使组蛋白和这些启动子的结合率大幅度下降，继而启动基因的转录。

Vhs是一种由UL41基因编码的内切核糖核酸酶，是最重要的初级蛋白，最早启动细胞基因表达攻击，主要在感染的早期和早期阶段合成，在HSV的发病、毒力和复制过程中发挥极其关键的作用。它能够降解所有类型的RNA，但在受感染的细胞中，vhs只会破坏mRNA来减少细胞翻译的病毒竞争，从而更容易建立和促进病毒感染的进展。相反，Vhs通过稳定gE/gL复合物使病毒mRNA高度稳定，而gE/gL复合物是细胞间传播所必需的。它能减少先天和适应性免疫应答蛋白的合成，从而阻断I型干扰素系统、树突状细胞并减少促炎细胞因子和趋化因子的产生。

2.3病毒的转录和表达

病毒在进入细胞核后，在宿主连接酶的作用下会迅速环化，VP16首先激活病毒基因转录活性，招募转录相关蛋白因子使立即早期基因开始转录，并最先表达出ICP0。ICP0能激活HSV 的E基因和L基因的表达，激活病毒基因组的转录。随之ICP22激活ICP0， ， 基因的转录，在宿主细胞RNA聚合酶II的催化下，转录成病毒mRNA。

三种基因之间相互作用，在DNA复制前，首先会有 基因的转录，调节着 基因和 基因的表达， 、 基因的转录分别需要 、 蛋白的存在，也会使 、 蛋白后期的合成速度下降。

基因最先转录，同时，也是最先表达的基因，它有启动、指导 和 基因的转录表达作用，表达成6种多肽：ICP0，ICP4，ICP22，ICP27，ICP47，Us1.5。在这6种多肽中，除去ICP47，其余5种都与基因的转录调节密切相关。ICP0、 ICP4和ICP27调控早期和晚期病毒基因的基因表达和转录;ICP22和US1.5在病毒感染过程中，对细胞凋亡分别存在有对抗和促进的作用。

基因表达的 蛋白质主要参与病毒基因组复制（例如：HSV DNA聚合酶，UL30）、核昔酸代谢（如胸昔激酶UL23），抑制早期的 基因的表达和激活 基因。 蛋白的表达标志着病毒DNA开始复制和 基因表达。病毒DNA在核内W圆环机制复制。最后是 基因的转录，在 、 多肽的作用下，表达病毒的衣壳结构蛋白、被膜蛋白和参与衣壳装配与转运的蛋白。

ICP0在潜伏性感染与裂解性感染之间，调节着他们的平衡，在HSV的活化成感染状态的调控中发挥着及其重要的作用，并能在早期破坏ND10。ICP0 具有E3泛素连接酶（ubiquitin-ligase enzymes）的功能，首先，它对病毒基因的转录和表达有调节作用;其次，它还能和宿主细胞内的多种蛋白之间彼此互相作用，从而激活转录过程。并且诱导泛素依赖性蛋白质降解，间接调控细胞周期、病毒增殖等。最重要的一点，ICP0 可以影响干扰素通路，消除干扰素刺激应答基因（interfron  stimulated  gene，ISG）的抗病毒功能;同时介入NF- B和AP-1 信号通路，在HSV-1 与HIV-1 的超感染过程中，作为超感染因子激活HIV-1 的长末端重复序列（long terminal repeat，LTR）。

ICP22在病毒早期基因、晚期基因的表达中起着关键的作用，而且潜伏病毒的再激活也与之密切相关。ICP22基因编码区能编码两种蛋白质：ICP22和Us1.5。在病毒感染过程中，ICP22对细胞凋亡同时存在对抗与促进作用。在感染早期，ICP22与ICP27等蛋白对细胞凋亡起着对抗作用;但在感染后期，Us1.5与UL13蛋白等共同激活Caspace3，对细胞凋亡起着促进作用。同时，ICP22 还能和细胞周期蛋白依赖性激酶Cdc2共同发挥作用，加速溶胞途径。ICP22单独作用并不常见，更多的是和其他病毒蛋白共同作用，它无论对于细胞启动子还是病毒启动子均具有广泛的转录抑制作用，VP16能够特异性地解除ICP22对病毒立即早期基因表达的抑制作用。在HIV的感染过程中，ICP22与VP16两者相互作用，使宿主细胞的蛋白合成迅速减少，帮助病毒基因转录而抑制宿主基因转录，更有利于病毒的复制。

ICP27是一种由UL54基因编码的核质穿梭蛋白，多功能的基因表达调控因子，在感染期间起着重要作用， 主要调节病毒和宿主细胞mRNA的合成与成熟，最主要功能是将病毒mRNA从细胞核运输到细胞质，其中最值得注意的是对病毒早期及晚期基因表达的调节作用。它对I基因和E基因有抑制作用，使L基因活化，并促进E基因向L基因的表达，刺激病毒基因组的转录过程，来终止宿主细胞蛋白的合成。在感染初期，ICP27抑制宿主细胞RNA的粘接，之后它便能使RNA P-2移到病毒复制位点，帮助病毒RNA完成从胞核到胞质转移。这对ICP0和ICP4的分布起着决定性的作用，从而能使调节蛋白进入病毒颗粒而发挥作用。

2.4基因组的复制

在病毒复制早期，基因组以双向或 方式进行复制，产生许多环状子代DNA，到复制后期，DNA合成转向滚环复制（ 复制），形成大量首尾相连的线性多拷贝基因组串联体，这些串联DNA被称为“未成熟DNA”，是组装的最佳底物。复制起始位点结合蛋白（ori-binding protein）具有解旋酶（Helicase）的活性，可以将双链DNA解旋为单链DNA。单链DNA会结合许多拷贝的单链DNA结合蛋白（ssDNA-binding protein）以防重新形成双螺旋。病毒的ori位点随后会结合具有解旋酶活性的蛋白復合体以形成一个复制叉。在其中一条链上，该复合体会合成一个较短的RNA与该DNA互补，该RNA作为引物在DNA聚合酶的作用下会开始导引链的合成。在基因组的另一条单链上，DNA以冈崎片段的形式进行合成。

HSV DNA复制所必需的基因产物如DNA聚合酶、DNA结合蛋白、引物合成酶等，都位于UL上（UL 29、UL30、UL40），主要依赖于E蛋白。编码DNA复制各种酶：UL30、UL42等，此外，解旋酶-引发酶复合体（helicase-primase complex）是HSV复制的关键基因，它具有DNA解旋酶、引物酶、单链DNA依赖型ATP水解活性和与DNA结合能力的多种功能。这些复制相关酶直接参与病毒DNA复制过程，对病毒的复制产生重要作用。

病毒DNA合成至少需要七种病毒蛋白。其他病毒蛋白，主要是胸苷激酶、核糖核酸还原酶、dUTPase和尿苷酰DNA葡萄糖化酶，控制病毒核酸代谢。TK是一种磷酸转移酶，主要作用是介导脱氧胸苷进入DNA合成的旁路途径的一部分。

2.5组装和释放

核衣壳的组装在细胞核中进行，首先组装成具有外壳和内壳的空心球形原衣壳，然后壳内侧的支架蛋白被水解，病毒DNA再进入原衣壳的内在细胞核内，病毒支架蛋白（preVP22a）、门户蛋白（pUL6）、主衣壳蛋白（VP5）、病毒蛋白酶（UL26）共同组装成为基本衣壳，VP19C和VP23三聚体再与基本衣壳结合，然后再与六边形和五边形衣壳蛋白结合，形成球形原衣壳，其强度主要靠支架蛋白来支撑。在DNA包装以前或进行过程中，蛋白酶水解支架蛋白使原衣壳外壳构象改变，成为稳定的20面体结构，一条病毒DNA通过一个20面体顶部的一个入口进入原衣壳，成为成熟的病毒核衣壳。UL6蛋白即该入口的主要蛋白。

在成熟核衣壳形成之后，则被囊膜包裹，最后释放。其释放过程如下：首先，核衣壳通过出芽方式从被转运至的核内膜进入到核周间隙，获得临时囊膜;然后，有两种方式可以脱去囊膜。其一，病毒的核衣壳在临时囊膜与细胞外膜融合后，被释放到细胞质中，之后再通过高尔基体中形成新囊膜，通过出芽释放;其二，病毒囊泡进入高尔基体，获得成熟病毒中的糖蛋白，使富含糖蛋白的病毒颗粒与细胞膜融合，释放成熟的病毒颗粒。

至少六种病毒蛋白可确保病毒基因的稳定表达，并动员细胞蛋白有效合成病毒DNA和蛋白质。感染后，作为UL41基因的产物，外壳蛋白和细胞蛋白之间彼此互相作用，完成mRNA的即刻降解。另一种外膜蛋白VP16，则能增强 基因的表达。感染的细胞蛋白0、4和22（ICP0，ICP4和ICP22）是多功能病毒蛋白，其改变感染细胞的环境以允许病毒基因的有效高水平表达。 ICP0在细胞核和细胞质中均有表达; 其在泛素-蛋白小体通路中的作用正在研究中。ICP47是另一种多功能蛋白质;阻断感染初期的RNA剪接，并在感染后期，将病毒mRNA完成从细胞核到细胞质的转移。调节蛋白ICP0，ICP4和ICP22被细胞激酶（例如，细胞周期蛋白激酶，cdc2）和病毒 - 蛋白激酶（US3和UL13）磷酸化。 UL13使许多病毒和细胞蛋白磷酸化，并且经常成为抗病毒化疗的靶点。

3总结

HSV的复制是一个复杂的过程，其间涉及多种病毒基因表达的蛋白调控，共同作用控制。探明病毒的复制机制以及其中涉及的主要调节产物，能对HSV引起的疾病做出有效的防治措施。

*通讯作者：匡琳

作者简介：胡雅涵，女，本科在读，研究方向：临床医学;通讯作者： 匡琳，女，博士，研究方向：中西医结合皮肤性病学。

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