硫酸软骨素裂解酶产生菌的筛选及特性研究

葛雯

摘 要：分离硫酸软骨素裂解酶产生菌及克隆其编码基因是研究其酶学性质及最终实现低分子量硫酸软骨素高质高效生产的重要研究基础。本文利用透明圈法从白鲢鱼鱼腹中分离筛选出产硫酸软骨素裂解酶的S6菌株，经16srRNA序列分析，初步鉴定为气单胞菌，同时研究了该菌株的生长曲线和对抗生素的耐药性，为后续针对S6菌株次级代谢产物的研究奠定基础。

关键词：硫酸软骨素裂解酶;气单胞菌S6;抗生素;抗药性分析;生长曲线

Abstract：Solation of chondroitin sulfate lyase producing strain and cloning of its coding gene are the important research basis for studying its enzymatic properties and ultimately realizing high quality and efficient production of low molecular weight chondroitin sulfate. In this paper， S6 strain producing chondroitin sulfate lyase was isolated and screened from the belly of silver carp by transparent circle method. After 16s rRNA sequence analysis， it was preliminarily identified as Aeromonas. At the same time， the growth curve and antibiotic resistance of this strain were studied， which laid a foundation for the subsequent study of secondary metabolites of S6 strain.

Key words：Chondroitinase; Aeromonas S6; Antibiotics; Antibiotic resistance; Growth curve

硫酸软骨素（Chondroitin Sulfate，CS）是一种分子量在20～50 ku的酸性黏多糖类生物大分子，广泛存在于动物和人软骨组织中[1]。其结构是由D-葡糖醛酸与2-乙酰氨基-2-脱氧-硫酸-D-半乳糖组成。硫酸软骨素具有多种生理与药理功能和作用，如抗动脉粥样硬化、抗凝血活性的作用[2]，以及在关节中的润滑和支撑功能等[3]。

研究发现，将硫酸软骨素的分子量降低至2～10 ku时，其药效更为明显，对防治动脉粥样硬化、风湿性炎症和伤口愈合有更好的疗效[4]。目前生物制药领域，主要采用硫酸软素裂解酶（Chondrotinase或Chondrotin sulfate lyase，ChSase）来制备低分子量的硫酸软骨素，常采用酸水解法、离子交换法和酶解法[2]。其中，酶解法所需要的反应条件相对简单且容易控制，较之前两者有较高的性价比和优势。

酶解法中，硫酸软骨素酶的主要来自于微生物的发酵产物。比如，普通变形杆菌（Proteus vulgaris）[5]、肝素黄杆菌（Flavobacterium heparinum）[6]、奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）等好氧细菌一直是主要的硫酸软骨素酶来源。此外，从多型拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomi-cron）、粪便拟杆菌（Bacteroides stercoris）等厌氧细菌中也能获得较高含量的硫酸软骨素酶[7]。国内目前科研和医疗所需产品主要来自于国外进口，价格相对昂贵。本研究为实现国产硫酸软骨素裂解酶生产的可能，在学习众多国内外文献后，从白鲢鱼鱼腹中分离得到一株产酶活性较高的气单胞菌S6菌株。通过透明圈变化筛选突变株，并通过进一步研究该菌株对抗生素的耐药性，为后续对硫酸软骨素裂解酶编码基因相关研究奠定了实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本实验以鱼、海肠、扇贝、海胆、鲍鱼等的内脏以及各地土样作为筛菌样本来源;抗生素：氨苄青霉素（Am）、卡那霉素（Km）、四环素（Tc）和氯霉素（Cl）;酶及试剂：质粒提取试剂盒购自BIOMIGA公司;各种Tag酶、Extag酶、Buffer、dNTP及其他试剂分别购自Sigma、TAKARA等公司。

1.2 培养基

①LB培养基。胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化钠10.0 g，固体培养基加入1.5%琼脂粉，用去离子水定容至1 L，调节pH至7.0，121 ℃灭菌30 min。②BBL培养基。（BD公司提供的BactoTM Brain Heart Infusion）牛脑浸出物7.7 g（提自200 g原料），牛心浸出液9.8 g（提自250 g原料），蛋白胨10.0 g，葡萄糖2.0 g，氯化鈉5.0 g，Disodium磷酸盐2.5 g。将上述混合物按比例取37 g溶于1L去离子水中。加热溶化并不断搅拌以混合均匀。在121 ℃下灭菌15 min。③BBL+培养基。BBL培养基148 mL（10.4 g BBL溶于148 mL去离子水中），5%牛血清白蛋白溶液40 mL，2%硫酸软骨素混合物溶液12 mL，硫酸软骨素的终浓度为1.2 mg·mL-1。

1.3 实验方法

（1）原始菌株的采集。产硫酸软骨素裂解酶的菌株主要是从水生生物的肠道内提取。本实验以鱼、海肠、扇贝、海胆、鲍鱼等的内脏以及各地土样作为筛菌样本来源，将采集到的样品装于无菌自封袋中保存，并在实验室的超净工作台上，利用平板划线单菌落法对不同的菌落进行纯化，用于后续筛选。

（2）產酶菌株的获取。利用大分子的硫酸软骨素与适当浓度的牛血清白蛋白混合后，与一定浓度的冰醋酸溶液可发生浑浊反应原理，而已被裂解的小分子硫酸软骨素则不发生该反应的原理，对菌落平板进行透明圈筛选，得到目的菌株[8]。如图1所示，用平板稀释分离法分离后的菌株，同时平行划短线法接种BBL平板和BBL+平板，菌落编号要对应。划完短线的菌置于28 ℃培养箱中培养24 h后，在长出菌落的BBL+平板上覆盖一层浓度为2 mol·L-1的冰醋酸溶液，观察菌落周围是否产生透明圈。如产生透明圈，在BBL平板上找到相应位置的同一菌株，液体培养后进行菌种保存。

（3）菌种鉴定。采用16srDNA PCR的方法得到所筛菌株的16srDNA基因片段，将该序列送去公司测序，可得全序列编码，在EzTaxon网站上将测序得到的基因序列与数据库序列进行比对，从而鉴定出所筛得菌株的种属关系。

（4）抗生素抗性分析。①本实验主要检测所筛选的产酶菌株对卡那霉素、氯霉素、氨苄青霉素和四环素的抗性反应。将上述各种抗生素配制成浓缩液，过滤除菌后作为贮液备用。使用时稀释到所需浓度，等LB培养基的温度下降到50～60 ℃时，加入适量的抗生素溶液，制成含抗生素的LB液体培养基若干。②将受体菌株S6在固体LB培养基上活化，28 ℃培养24 h。之后，挑取单菌落接种于10 mL已灭菌的LB液体培养基中，28 ℃振荡培养24 h后测OD600值。当OD600值为1时，按1%的接种量，将受体菌株S6接种于含有相应浓度抗生素的5 mL LB液体培养基中，于28 ℃培养72 h后，检测其生长情况。

（5）产酶菌株生长曲线的测量。为了解产酶菌株气单胞菌S6的生长规律，为后续试验做好准备工作，本实验用分光光度计进行光电比浊测定不同培养时间细菌悬浮液的OD值，绘制生长曲线：①挑取S6单菌落，接种于10 mL已灭菌的LB液体培养基中，置于28 ℃摇床振荡培养18 h。②用移液管吸取2 mL菌悬液接入盛有100 ml LB液体培养基的三角瓶内，混合均匀后于28 ℃摇床中振荡培养。③比浊测定：用未接种的LB液体培养基作空白对照，选用600 nm波长进行光电比浊测定。在培养后每1 h吸取3 mL菌液置于比色皿中测取吸光值。使其光密度值在0.2～0.8。④需做3次平行试验，记录数据并根据数据绘出气单胞菌S6的生长曲线图。

2 结果与分析

2.1 野生菌株筛选结果

根据大分子的硫酸软骨素与适当浓度的牛血清白蛋白混合后，与一定浓度的冰醋酸溶液可发生浑浊反应，而已被裂解的小分子硫酸软骨素不发生该反应的原理，对菌落平板进行透明圈筛选。从分离和培养的野生菌中，可得到产生明显透明圈的菌株（见图2）。实验采用定量测量透明圈直径与菌落直径比值的方法来衡量野生菌产酶效率，统计测量结果见表1。

2.2 野生菌菌种鉴定结果

由透明圈和菌落直径的比值可知，S6号菌产生硫酸软骨素裂解酶的效率最高，从中选取S6菌株进行测序，并把得到的基因序列与EzTaxon数据库中的菌种序列进行同源性比对，鉴定其种类，可知S6号菌属于气单胞菌，是从白鲢鱼鱼腹中分离所得。

2.3 产酶菌株S6对不同抗生素的抗性结果和分析

分别检测S6对氨苄霉素、卡那霉素、氯霉素和四环素的抗性，结果表明：S6对氨苄霉素具有一定的抗性，对卡那霉素、四环素和氯霉素基本没有任何抗性。具体统计结果见表2。

2.4 产酶菌株S6生长曲线的测量结果

在28 ℃摇床中培养已分离纯化得到的S6菌株，每隔1 h吸取一定量的发酵菌液稀释至所需浓度，使用分光光度计在600 nm波长光线下，进行光电比浊测定不同培养时间细菌悬浮液的OD值。注意稀释后菌液的OD值要位于0.2～0.8。根据稀释倍数换算后得数据表格，绘制气单胞菌S6的生长曲线如图3。由图3知，菌株在生长2～10 h为对数生长阶段，在生长10 h之后进入稳定期。

3 讨论与结论

本实验通过从鱼、海肠、扇贝、海胆、鲍鱼等的内脏以及各地土样中筛选，分离得到一株产硫酸软骨素裂解酶菌株S6，经鉴定确定为一种气单胞菌。通过抗生素抗性分析可知，该产酶菌株对卡那霉素、四环素和氯霉素几乎没有抗性，是利用Tn5转座子质粒插入进行基因邮编的良好目的菌株。另外，通过对产酶菌株S6长曲线的测定，可知该菌株在生长2～10 h为对数生长阶段，在生长10 h之后进入稳定期，为后续针对S6菌株次级代谢产物的研究做好了准备工作。

参考文献：

[1]方洋涛，牟海津，杨苏晓，等.产硫酸软骨素酶菌株发酵条件优化及酶学性质[J].食品科技，2018，43（12）：1-7.

[2]徐丽萍，姜 喆，姚鹏程，等.硫酸软骨素提取工艺优化及抑菌活性研究[J].哈尔滨商业大学学报（自然科学版），2019，35（5）：573-580.

[3]杨宝华.氨基葡萄糖联合硫酸软骨素治疗膝骨关节炎的效果[J].临床医学研究与实践，2018，3（35）：83-84.

[4]阎浩林，何汉洲，蔡苏兰，等.硫酸软骨素酶产生菌的筛选及酶的分离纯化[J].微生物学报，2004（1）：79-82.

[5]Yamagata T，Saito H ，Habuchi O，et al.Purifi-cation and Properties of Bacterial Chondroitinases and Chondrosulfatases[J].The Journal of biological chemistry，1968，243（7）：1523-1535.

[6]Gu K F，Linhard R J，Laliberte M，et al.Purication，Characterization and Speficity of Chondroitin Lyases and Glycuronidase From Flavobacterium Heparinum[J].Biochem Journal，1995，133：383-386.

[7]Ahn M Y，Shin K H，Kim D H，et al.Character-ization of a Bacteroides Species From Human Intestine That Degrades Gy2 cosaminoglycans[J].Canadian Journal of Microbiology，1998，44（5）：423-429.

[8]Kenan G U，Robert J.Purification，characterization and specificity of chondroitin lyases and glycuronidase from Flavobacterium heparinum[J].Biochemical，1995，312，569-577.