HPLC法测定面包中脱氢乙酸的不确定度评定

葛静微 沈莹萍 马芮萍 杨阳

摘 要：评定高效液相色谱法测定面包中脱氢乙酸含量的不确定度。依据国家计量技术规范JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》，建立脱氢乙酸不确定度的数学模型，并对各不确定度分量进行分析，计算合成不确定度和扩展不确定度。结果表明，当样品中脱氢乙酸的含量为0.2547 g·kg-1时，其扩展不确定度为0.0065 g·kg-1（P=95%，k=2），标准曲线配制、标准曲线拟合、加标回收、重复性测量是测量不确定度的主要来源。

关键词：面包;脱氢乙酸;不确定度;高效液相色谱法

Abstract：Uncertainty of determination of dehydroacetic acid in bread was evaluated by high performance liquid chromatography method. The sources of uncertainty in determination of dehydroacetic acid were analyzed according to the national measurement technical specification JJF 1059.1-2012 Evaluation and expression of uncertainty in measurement. The combined uncertainty and extended uncertainty were calculated by establishing mathematical model. The results showed that the expanded uncertainty was 0.006 5 g·kg-1（P=95%，k=2） when the dehydroacetic acid content was 0.2547 g·kg-1， which was greater caused by preparation of standard solution， curve fitting， standard addition recovery and repeatability of determination.

Key words：Bread; Dehydroacetic acid; Uncertainty; High performance liquid chromatography method

脫氢乙酸又名脱氢醋酸，是一种应用广泛的防腐剂，对霉菌、酵母菌、细菌具有很好的抑制作用，抑菌效果是苯甲酸的2～10倍，广泛用于果汁、腐乳、酱菜及糕点中[1]。脱氢乙酸能够被人体迅速吸收，影响人体的肾脏、肝脏以及中枢神经系统[2]，并可能引发癌症[3]。我国食品添加剂使用标准GB 2760-2014中规定[4]脱氢乙酸在面包中的限量是0.5 g·kg-1。因此，对食品中脱氢乙酸的使用进行监管显得尤为重要，而检测的准确性是监管的基础。

不确定度评估是表示检验结果准确性的重要方式，能够表明结果的可信赖程度，是衡量测量结果的重要指标[5-7]，是表征合理地赋予被测量值的分散性，与测量结果相联系的参数，其数值的大小反映了测量结果质量的高低，并直接与检验结果的合格判定相关[8]。因此，不确定度的分析评定在日常检测工作中极为重要，对于面包中脱氢乙酸不确定度评定具有重要意义。

目前，面包中脱氢乙酸含量不确定度评定尚未见报道，本文采用GB 5009.121-2016中样品前处理方法，高液相色谱法进行检测，并根据JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》[9]、JJG 196-2006《常用玻璃量器检定规程》[10]及其他不确定度评定方法对测定结果进行不确定度分析评定，可为面包中脱氢乙酸含量检测的实验室评定不确定度提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪：U3000液相色谱仪配荧光检测器和Chromeleon 7色谱工作站，美国Thermo公司;脱氢乙酸标准溶液物质BW900901-1000-C（1000 μg·mL-1）：坛墨标准物质中心;甲醇（色谱纯）：德国默克公司;乙酸铵（色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司;氢氧化钠、正己烷和硫酸锌均为分析纯：天津市科密欧化学试剂有限公司;超纯水（电阻率18.2 mΩ·cm-1）：Millipore纯水仪制备。

1.2 试验方法

参考GB 5009.121-2016《食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定》。

1.2.1 样品前处理

称取2 g（精确至0.001 g）试样，置于25 mL离心管中，加入约10 mL水、5 mL硫酸锌溶液（120 g·L-1），用氢氧化钠溶液（20 g·L-1）调pH至7.5，转移至25 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。置于离心管中，超声提取10 min，转移到分液漏斗中，加入10 mL正己烷，振摇1 min，静置分层，弃去正己烷层，加入10 mL正己烷重复进行一次，取下层水相置于离心管中，4 000 r·min-1离心10 min。取上清液过0.22 μm有机滤膜，供高效液相色谱测定。

1.2.2 色谱条件

色谱柱：C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）;流动相：甲醇-0.02 mol·L-1乙酸铵（体积比为10∶90），流速为1.0 mL·min-1，等度洗脱;紫外检测器：波长为293 nm。

1.2.3 定量方法

用浓度为1 000 μg·mL-1的脱氢乙酸标准物质溶液逐级稀释，配成浓度分别为1、2、5、10 μg·mL-1和20 μg·mL-1的校准曲线溶液，外标法定量。

1.2.4 脱氢乙酸含量的计算公式

按照式（1）计算脱氢乙酸的含量：

（1）式（1）中，X-试样中脱氢乙酸的含量，单位g·kg-1;C-试样溶液中脱氢乙酸的质量浓度，单位μg·mL-1;C0-空白试样溶液中脱氢乙酸的质量浓度，单位μg·mL-1;V-试样溶液总体积，单位mL;m-称取试样的质量，单位g;1000-换算因子。

2 结果与分析

2.1 不确定度及来源分析

不确定度评定参数分为A类和B类，A类评定是指在规定测量条件下测得量值用统计分析的方法进行测量不确定度分量的评定，B类评定是指用不同于测量不确定度A类评定的方法对测量不确定度分量进行评定[9，11]。通过对全过程的分析，脱氢乙酸不确定度的主要来源有：标准物质浓度、标准物质配制、标准曲线拟合、样品称量、样品定容、重复性测定和加标回收率等。

2.2 标准物质不确定度评定

2.2.1 标准物质浓度的不确定度Urel（1）（B类）

查标准物质证书，脱氢乙酸浓度为1 000 μg·mL-1，不确定度为2%，按均匀分布计算，包含因子k=2，由标准物质引入的相对标准不确定度为：（2）

2.2.2 标准物质配制的不确定度

（1）标准中间液配制的不确定度Urel（2）（B类）。标准中间液配制过程中使用20 μL的移液器吸取

20 μL的脱氢乙酸标准溶液用水定容至10 mL容量瓶，20 μL的移液器容量允许误差4.0%，按均匀分布考虑，k=，移液器引入的相对标准不确定度urel（移液器）为：

（3）根据《化学分析中不确定度的评估指南》[12]，玻璃量器引入的不确定度服从三角分布，包含因子k=，10 mL容量瓶（A级）最大允许差为±0.020 mL，相对标准不确定度为：

（4）标准中间液配制的相对标准不确定度为：

（2）标准工作溶液配制的不确定度Urel（3）（B类）。用1 000 μL移液器分别移500 μL、100 μL标准中间液（20 μg·mL-1）于1mL容量瓶中，用水定容，用250 μL移液器移250 μL标准中间液（20 μg·mL-1）于1 mL容量瓶中，用水定容，再用100 μL移液器移取50 μL标准中间液（20 μg·mL-1）于1 mL容量瓶中，用水定容，配成浓度分别为1、2、5、10 μg·mL-1和20 μg·mL-1的校准曲线溶液。该过程涉及容量瓶、移液器引起的不确定度。

1 mL容量瓶（A级）最大允许差为±0.010，服从三角分布，k=，5个容量瓶相对标准不确定度为：

1 000 μL移液器吸取500 μL时容量允许误差±1.0%，吸取100 μL時容量允许误差±2.0%，250 μL移液器吸取250 μL时容量允许误差±1.5%，100 μL移液器吸取50 μL时容量允许误差±3.0%，按均匀分布，k=，则相对标准不确定度为：

2.2.3 标准工作曲线拟合引入的相对不确定度Urel（4）（A类）

分别测定浓度为1、2、5、10 μg·mL-1和20 μg·mL-1的标准溶液2次，计算平均值，得到相应的峰面积Y，结果见表1。

以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合得到线性回归方程及R2。对样品进行两次平行测定，得到样品浓度平均值C0=10.2541 μg·mL-1，标准溶液浓度平均值C=7.6 μg·mL-1。由标准曲线拟合引入的不确定度式（12）中，S为标准溶液峰面积残差的标准偏差，S=0.028 19;k为标准工作曲线的斜率，k=0.437 7;p为对的测定次数，p=2;n为标准工作溶液点的测定次数，n=5;C为标准工作液的平均浓度，C=7.6 μg·mL-1;（C0-C）=105.146 6;（Ci-C）=241.2。

2.3 样品前处理引入的不确定度Urel（5）（B类）

2.3.1 样品称量产生的不确定度

2.3.2 样品定容产生的不确定度

样品经称量、加水和硫酸锌，氢氧化钠调pH后，定容于25 mL，25 mL容量瓶（A级）容量允差为±0.03 mL，服从三角分布，k=，由容量瓶定容产生的相对标准不确定度由样品前处理引入的标准不确定度：

2.4 重复测量产生的不确定度Urel（6）（A类）

对面包中脱氢乙酸含量进行8次重复性测定，结果分别为0.253 6、0.255 1、0.253 9、0.251 6、0.254 3、0.256 5、0.255 4 g·kg-1和0.2574 g·kg-1，平均值X为0.2547 g·kg-1，标准偏差，标准不确定度，由重复测量产生的相对标准不确定度：

2.5 加标回收引入的不确定度Urel（7）

按照1.2.1试验方法对样品进行添加回收率试验，在5 μg·mL-1添加水平下，进行5次平行试验，添加回收率分别为93.41%、90.53%、91.54%、92.06%和91.35%，平均值为X=91.78%，标准偏差S为0.0107，相对标准不确定度：

2.6 合成标准不确定度及扩展不确定度

2.6.1 合成标准不确定度

各相对标准不确定度分量合成：

2.6.2 扩展不确定度

3 测量结果及不确定度报告

高效液相色谱法测定面包中脱氢乙酸的结果报告为：

4 结论

实验测得当面包中脱氢乙酸含量为0.254 7 g·kg-1时，其测量不确定度为（0.254 7±0.006 5）g·kg-1（k=2，P=95%）。

面包中脱氢乙酸含量的测定过程中，标准物质浓度、标准物质配制、标准曲线拟合、样品前处理、重复性测定、加标回收率等均会引入不确定度，通过分析发现标准溶液配制、标准曲线拟合、加标回收、重复性测量是测量不确定度的主要来源。

因此，在实际检测过程中要定期对设备进行计量检定、期间核查与维护保养工作[13];要严格把控标准溶液的配制和样品测量的过程，要加强操作人员的培训，提高操作技能，尤其是标准溶液的配制过程，使用精密度较高的量具、准确操作，以减少样品测量过程中的误差，保证测量结果的准确性和可靠性。

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