响应面优化超声辅助法提取拐枣种子中二氢杨梅素的工艺

张晓南 朱鸿维 赵善舶 白 晨 石雅楠徐浩朋 尹 恋 胡淑敏 尹 花*

(1.青岛啤酒股份有限公司，啤酒生物发酵工程国家重点实验室，青岛 266071； 2.东北农业大学食品学院，哈尔滨 150036)

拐枣(HoveniadulcisThunb.)为鼠李科(Rhamnaceae)枳椇属(Hovenia)高大乔木，主要分布于我国华北、西、华东、西南等地区[1]。嫩枝、幼叶背面、叶柄和花序轴初有短柔毛，后脱落。叶片椭圆状卵形、宽卵形或心状卵形；果柄含多量葡萄糖和苹果酸钾，经霜后甜，俗称“拐角”[2]，拐枣的成熟种子(又称枳椇子)[3]呈暗褐色或黑紫色，近扁球形，有光泽，民间常用来泡水喝，可以快速缓解和治疗身体的某些不适感觉[4～5]。

过量饮酒会导致乙醇中毒而引发肝脏受到损伤[6～8]，乙醇进入人体后，大部分在肝脏中代谢，只有少量的乙醇通过胃肠道排出。大量滞留的乙醇代谢最终会造成人体的乙醛中毒现象，长期饮酒会导致酒精性肝病、肝硬化疾病的生成[9～10]。拐枣种子的临床应用主要针对大量饮酒后的症状如：头晕，乏力，烦渴，呕吐等现象[11]。有文献报道：拐枣种子中的二氢杨梅素(Dihydromyricetin)(见图1)是较为特殊的黄酮类化合物[12～13]，它具有解除醇中毒、预防酒精肝、抑制肝细胞恶化、降低血脂和血糖水平的作用；同时经药理实验表明，二氢杨梅素对枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、大肠埃希菌、产气杆菌、啤酒酵母、黏红酵母、青霉、黑曲霉、黄曲霉、毛霉及根霉均有抑菌作用[14～16]。

图1 二氢杨梅素的化学结构式Fig.1 The chemical structure of dihydromyricetin

超声辅助提取是近年来发展起来的新型提取技术，超声波所独具的物理特性能促使植物细胞组织破壁或变形，使有效成分提取更充分，提取速度快，能耗较低[17～18]。超声辅助技术对拐枣种子二氢杨梅素的提取研究也未见报道。因此本文为首次创新，采用超声法以二氢杨梅素得率为响应因子对拐枣种子中的二氢杨梅素进行提取，并采用响应面优化单因素提取结果，为规模化生产提供了重要的理论价值和研究意义。

1 材料和方法

1.1 实验材料、试剂和仪器

拐枣种子采购于哈尔滨三棵树中药材市场，经东北农业大学食品学院江连洲教授鉴定后备用。原料预处理、清除机械杂质(砂子草棍等)后，粉碎至250～850 μm范围内，含水率为10.3%，备用。色谱纯甲醇购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；对照品二氢杨梅素购于上海安谱实验科技股份有限公司；其他常规化学试剂为国产分析纯。超纯水采用(RX-UPT,上海和泰仪器有限公司)流动水净化仪制得。

KJ-1340AL型台式超声波提取装置(广东深圳柯洁有限公司)，超声浴槽尺寸360 mm×180 mm×235 mm；3K30型离心机(SIGMA公司)；美国Waters e 2695-2489高效液相色谱仪，Supelco Discovery C18色谱柱(尺寸：250 mm×4.6 mm,5 μm)。

1.2 实验方法

1.2.1 原料脱脂处理

取处理后的拐枣种子粉末100 g置于2 L三角瓶中，加入1 000 mL石油醚(沸程60～90℃)，180 W超声脱脂，超声时间1 h，滤出石油醚，用旋转蒸发仪回收石油醚，再将回收的石油醚(适当补加新石油醚)1 000 mL再于180 W功率超声脱脂1 h，如此重复3次。得到的脱脂原料置于平盘通风橱中自然放置过夜，彻底挥干石油醚，置于夹链袋中保存，作为进一步提取的实验材料，回收的石油醚留做下次使用。

1.2.2 实验条件1.2.2.1 高效液相色谱定量测定条件

采用高效液相色谱法定量测定二氢杨梅素。流动相为甲醇-0.02 moL·L-1硫酸二氢钾，洗脱流速为1.0 mL·min-1，柱温25℃，进样体积10 μL。二氢杨梅素检测波长为290 nm,运行时间为20 min。

1.2.2.2 标准曲线的绘制

分别精密称取对照品二氢杨梅素2.5 mg置于25 mL容量瓶中，流动相溶解并定容，得每毫升含二氢杨梅素0.1 mg的对照品储备液备用。分别精密吸取对照品储备液0.5、1、2、4和6 mL，置于10 mL容量瓶中，流动相定容，配成不同浓度的对照品溶液。依次取10 μL上述对照品溶液进样，每个浓度重复3次。按上述色谱条件测定，绘制标准曲线，计算回归方程。二氢杨梅素在0.005～0.1 mg·mL-1之间呈良好的线性关系。其线性回归方程为y=2 278 019x-610 490，R2=0.999 9。

1.2.2.3 样品中二氢杨梅素的含量测定

提取液稀释至适宜的检测浓度后，过0.45 μm微孔滤膜，取滤出液进行HPLC检测，每样重复进样3次，将峰面积取平均值，代入回归方程，依式1计算二氢杨梅素的得率。

Y%=c×V/M

(1)

式中：Y为二氢杨梅素得率%；c为二氢杨梅素的浓度(mg·mL-1)；V为提取液体积(mL)；M为原料重量(g)。

1.2.3 影响提取效果的因素试验1.2.3.1 单因素试验

准确称取0.5 g(绝干计)拐枣种子脱脂干燥粉末原料，置于100 mL锥形瓶中，于超声波提取器中在多种条件下提取，以确定提取因素变化范围以及各因素的适宜值。将每次提取液过0.45 μm微孔滤膜，通过公式计算二氢杨梅素得率。

1.2.3.2 工艺优化实验

在单因素试验的基础上，选取A料液比，B超声辐照功率，C超声辐照时间共3个影响因子进行响应面分析，考虑到实验因素对得率的影响是曲线关系，故采用响应面法寻找最佳工艺条件。根据响应面Box-Behnken设计原理，以单因素试验中最佳水平作为响应面设计的0水平，设计试验方案，取得试验结果后，采用3因子3水平的响应面分析法，得到二次回归方程，并找出最佳工艺参数(见表1)。

表1 Box-Behnken设计因素编码水平

Table 1 Levels of Plackett-Burman design extraction variables

代码Code因素Factors水平Level-10+1A液料比Liquid-solid ratio(mL·g-1)152025B超声辐照功率Ultrasound irradiation power(W)108144180C超声辐照时间Ultrasound irradiation time(min)203040

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇体积分数对提取效果的影响

因拐枣种子中二氢杨梅素易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂中，乙醇是毒性最低的有机溶剂，且对植物细胞壁有较强的穿透能力，对许多成分溶解性能好，所以本研究采用乙醇溶液为提取溶剂。不同体积分数的乙醇极性不同，对极性不同的物质具有不同的得率。在保持其他条件不变(超声辐照时间30 min，提取温度40℃，超声辐照功率为180 W，液料比20 mL·g-1)，改变提取溶剂乙醇的体积分数，拐枣种子中二氢杨梅素的提取得率如图2。由图2可以看出，二氢杨梅素的得率受乙醇体积分数的影响较大[19]。随着乙醇体积分数的增加，二氢杨梅素得率逐渐增加，当乙醇体积分数达到60%时，二氢杨梅素得率达到最高。但随着乙醇体积分数继续增大，二氢杨梅素的得率反而略有降低。因此选择乙醇体积分数为60%作为从拐枣种子中提取二氢杨梅素的溶剂。

图2 乙醇体积分数的影响Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on yield of dihydromyricetin

2.1.2 液料比对提取效果的影响

实验中选择合适的液料比可减少溶剂的浪费，也会使提取过程工序简化，同时也减少溶剂回收带来的麻烦。在保持其他条件不变(乙醇体积分数60%、提取温度40℃、超声辐照功率180 W和超声辐照时间30 min)，改变液料比，拐枣种子中二氢杨梅素的得率见图3。由图3可以看出，得率随液料比的增大而升高，超过20 mL·g-1后升高缓慢。确定提取的液料比范围是15～25 mL·g-1。

图3 液料比的影响Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on yield of dihydromyricetin

图4 乙醇体积分数的影响Fig.4 Effect of temperature on yield of dihydromyricetin

图5 超声辐照功率的影响Fig.5 Effect of ultrasound irradiation power on yield of dihydromyricetin

图6 超声辐照时间的影响Fig.6 Effect of ultrasound irradiation time on yield of dihydromyricetin

2.1.3 超声温度对提取率的影响

超声提取温度对提取会有影响，在保持其他条件不变(乙醇体积分数60%、液料比20 mL·g-1、超声辐照功率180 W和超声辐照时间30 min)，采用不同温度(30、40、50和60℃)对拐枣中二氢杨梅素进行提取，结果如图4所示：在实验设定的温度范围(30～60℃)内，二氢杨梅素的提取得率相差不大。比较而言，40℃的温度可以满足要求。

2.1.4 超声辐照功率对提取效果的影响

图5为乙醇体积分数60%，提取温度40℃，液料比20 mL·g-1，超声时间30 min的提取结果。在实验过程中，我们把超声辐照功率分别设置成72、108、144和180 W 4个辐照功率梯度。由图5可知：随着超声辐照功率的增加，二氢杨梅素的得率逐渐增加，功率在180 W有最大得率。这是因为对于固定频率的超声波来说，功率增大，声强随着增大。单位时间内超声产生的空化事件增多，从而有利于得率的提高。但是不能无限制的增大超声功率，功率过大，导致能耗过高，操作噪音增强。为了进一步明确超声辐照功率对二氢杨梅素得率的影响，选取超声辐照功率在108～180 W进行优化设计。

2.1.5 超声辐照时间对提取效果的影响

提取时间决定着生产周期的长短，决定着生产成本和能源的消耗，是生产工艺研究中一个十分重要的影响因素。当溶剂为60%浓度的乙醇、提取温度40℃、超声辐照功率180 W、液料比为20 mL·g-1的情况下，不同超声辐照时间对二氢杨梅素得率的影响见图6。可以看出随着超声辐照时间的增加，二氢杨梅素得率逐渐增加，超过30 min后二氢杨梅素得率增加的趋势有所降低。因此超声辐照时间在20～40 min作为进一步考察范围。

2.2 响应面优化

在单因素实验结果基础上，利用Box-Behnken响应面分析法进行设计。实验具体设置显示在表2中，17个实验中序号13～17为5个中心实验，用以分析实验误差；其余12个为析因实验。以二氢杨梅素得率(Y)为响应值，经回归拟合各影响因子与响应值的回归方程为：

Y=-3.50+1.37A+1.93×10-1B+6.33×10-1C-1.93×10-3AB-7.37×10-3AC-1.04×10-3BC-2.15×10-2A2-4.33×10-4B2-5.63×10-3C2

(1)

表2 Box-Behnken实验设计及结果

Table 2 Box-Behnken experimental design and results

序号No.A:液料比Liquid-solid ratio(mL·g-1)B:超声辐照功率Ultrasound irradiation power(W)C:超声辐照时间Ultrasound irradiation time(min)二氢杨梅素得率Yield of dihydromyricetin(mg·g-1)120108200.64220108401.37320180201.42420180400.66515144200.66615144401.36725144201.47825144400.69915108300.701015180301.211125108301.581225180300.701320144302.091420144302.181520144302.111620144302.181720144302.17

通过表3的方差分析结果可以看到二氢杨梅素得率回归方程各变量对指标影响的显著性。概率P值越小，表明相应变量的显著程度也越高。各因素中平方项A2、B2、C2，交互作用项AB、AC、BC对二氢杨梅素得率的影响均为极显著(P<0.01)，A对二氢杨梅素得率的影响为显著(P<0.05)，可见，所涉及的液料比、超声辐照功率和时间因素对响应值二氢杨梅素得率的影响不是简单的线性关系，各因素对二氢杨梅素得率影响主要是二次方效应和交互效应。表3中回归方程的P值小于0.000 1表明可以利用该模型对拐枣中二氢杨梅素提取效果进行分析。失拟项是用来评估方程可靠性的一个指标，方程分析结果显示失拟项F值为6.09，不显著，说明该回归方程拟合的比较好，可以很好地描述各因素与响应值之间的真实关系，利用该方程确定拐枣中二氢杨梅素的最佳提取条件[20]。由二次回归模型得到每2个因素同时对响应值的影响结果如图7所示。由图7可以看出，二氢杨梅素得率的响应曲面均为开口向下的凸面，且凸面中心在考察区域之内，表明在考察区域范围内存在响应值的最大值。通过Design-expert统计软件分析，得出拐枣种子中二氢杨梅素超声辅助提取的最佳条件为：液料比20.42 mL·g-1，超声辐照功率142.13 W，超声辐照时间29.78 min，二氢杨梅素理论得率为2.15 mg·g-1。

表3 二氢杨梅素得率回归方程方差分析

Table 3 Variance analysis of regression equation for dihydromyricetin

方差来源Source平方和Sum of squares自由度Degree of freedom均方Mean squareF值F-valueP值Prob>F显著性SignificantModel5.9690.66123.62<0.0001**A0.0310.036.020.0439*B0.0110.012.170.1843C0.0010.000.330.5853AB0.4810.4889.73<0.0001**AC0.5410.54101.37<0.0001**BC0.5610.56104.01<0.0001**A21.2211.22227.91<0.0001**B21.3211.32247.09<0.0001**C21.3311.33248.84<0.0001**残差Residual0.0470.01失拟合Lack of fit0.0330.016.090.0567纯误差Pure error0.0140.00总离差Cor total6.0016

注：*P<0.05；**P<0.01

2.3 最佳工艺条件验证

据理论最佳条件，为方便操作，选取各条件临近整数值，具体过程为：准确称取拐枣种子粉末0.5 g，按照液料比20.5 mL·g-1加入体积分数为60%的乙醇溶液，超声浴温度40℃，超声辐照功率140 W，超声辐照提取30 min，提取液过滤，过0.45 μm微孔滤膜，HPLC测定并计算二氢杨梅素得率，重复试验5次，数据取平均值，结果二氢杨梅素得率为2.14±0.09 mg·g-1，与理论预测值非常接近，误差小于5%，说明该最佳工艺条件合理可行，在该工艺下，得率最佳。从而验证了模型的正确性。

图7 各因素对二氢杨梅素得率的响应曲面图Fig.7 Effects of different factors on the yield of dihydromyricetin

3 结论

本实验采用超声辅助提取法从拐枣种子中提取二氢杨梅素，通过单因素实验探讨了乙醇体积分数、液料比、提取温度、超声辐照功率和时间对提取工艺的影响进行了考察，采用响应面法进行工艺优化，得到了满意的提取率[21]。得到的最优工艺条件为：乙醇体积分数60%；提取温度40℃；超声辐照时间30 min；超声辐照功率140 W，液料比20.5 mL·g-1。最佳工艺条件下拐枣种子中二氢杨梅素提取得率为2.14±0.09 mg·g-1，为实现拐枣资源高附加值的综合加工利用奠定了基础。