DDR1在TGF-β1诱导的腹膜间皮细胞间质转化中的作用及其机制

孔德亮,徐爱静,李 娟,赖学莉,郭志勇*

(1海军军医大学第一附属医院肾内科,上海 200433;2海军军医大学第一附属医院感染科;#共同第一作者;*通讯作者,E-mail:snxingwen@126.com)

腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)是肾脏替代的一种形式,而腹膜作为溶质和水交换的可渗透屏障,其持续暴露于透析液可引起腹膜的急慢性炎症和损伤,出现进行性纤维化,血管生成和血管病变,导致腹膜透析终止与永久性腹膜膜损伤[1,2]。人腹膜间皮细胞(human peritoneal mesothelial cells,HPMCs)作为腹膜结构的主要组成部分,其上皮间质转化在诱导纤维化和腹膜功能恶化等病理过程中起了主要作用[3,4]。因此,分析HPMC细胞的上皮间质转化在腹膜透析充分性中起了关键的作用[5]。

TGF-β1是诱导间质转化和肾纤维化的主要调节剂[6]。研究发现[7],在葡萄糖、酸性pH和感染的刺激下,TGF-β1的产生增多,从而促进器官纤维化过程中的细胞外基质(ECM)和胶原产生,主要表现为TGF-β1的过度表达与腹膜透析预后的恶化相关。盘状结构域受体1(discoid domain receptor 1,DDR1)是一种新型的受体酪氨酸蛋白激酶,能够通过与胶原蛋白结合,激活DDR1的活性,进而促进细胞的增殖、迁移和分化等[8]。有报道发现DDR1的表达是预测胃癌腹膜转移的一个生物标志物,DDR1的抑制在腹膜移植的小鼠模型中能诱导显著的抗肿瘤作用[9]。而研究证实,在肾小管上皮细胞沉默DDR1可以延缓细胞炎症反应和间质转化[10],且DDR1能激活间质转化[11]。以上研究提示,DDR1与腹膜存在一定相关性且可诱导组织间质转化的发生。但是有关DDR1与腹膜间质转化的关系尚不清楚,因此,本研究拟通过细胞实验探究DDR1在TGF-β1诱导的HPMCs间质转化中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验细胞 人腹膜间皮细胞株购自于美国ATCC公司(货号:HBT-113)。

1.1.2 试验试剂 TGF-β1(Proteintech公司);胎牛血清(Gibco公司);DDR1兔IgG一抗抗体、E-cadherin鼠一抗抗体和α-SMA兔一抗抗体(美国CST公司);β-actin鼠一抗抗体(江苏碧云天公司);Western blot一抗、二抗稀释液(江苏碧云天公司);HRP标记兔二抗、HRP标记鼠二抗(武汉博士德生物公司);DMEM细胞培养基(Hoyclone公司);BCA蛋白浓度定量试剂盒(江苏碧云天公司);蛋白marker(江苏碧云天公司);DAPI染料(江苏碧云天公司);CCK-8溶液(江苏碧云天公司);逆转录试剂盒(广州锐博公司);DDR1引物(广州锐博公司)。

1.1.3 主要仪器 细胞涡旋仪(武汉维塞尔生物科技有限公司);-80 ℃超低温冰箱(青岛海尔集团);4 ℃、-20 ℃冰箱(合肥美菱股份有限公司);超净工作台(湖南湘仪实验室仪器有限公司);CO2细胞培养箱(Thermo Scientific公司);脱色摇床(江苏盛蓝仪器制造有限公司);多功能酶标仪(Thermo赛默飞世尔);高速台式冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器有限公司);荧光倒置显微镜(日本/奥林巴斯Olympus);Western blot检测装置(美国Bio-Rad伯乐公司);高纯水机(美国Millipore公司)。

1.2 方法

1.2.1 人腹膜间皮细胞培养 将人腹膜间皮细胞放置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中并采用DMEM的高糖培养基中(含有1%的双抗,10%的胎牛血清)进行培养,细胞贴壁生长24 h。细胞生长密度达到90%时进行细胞传代操作:细胞培养瓶转至超净工作台内,倾去细胞培养基,加入适量的PBS进行润洗2次,加入胰酶消化2-3 min,加入培养基终止消化,离心5 min得到细胞沉淀,按照1 ∶3比例进行传代。

1.2.2 CCK-8检测细胞活力 HPMCs异常增殖与活化是腹膜纤维化的关键因素。为此,我们通过TGF-β1(0,5,10 μg/L)处理HPMCs检测其对细胞活力的影响,以得到合适的处理浓度。①将HPMCs细胞按照密度为1×104/孔种于96孔板内,待细胞贴壁生长12 h,倾去原培养基,加入终浓度为0,5,10 μg/L TGF-β1,并分别设为control组、5 μg/L组、10 μg/L组,每组均设置6个复孔,分别培养24 h;②避光条件下,每孔加入10 μl的CCK-8溶液,混合均匀,并于37 ℃、5%CO2培养箱内孵育1 h;③单功能酶标仪设置检测波长为490 nm测定各孔吸光度值;④依据各孔吸光度值进行OD值处理,细胞活力(%)=(试验组A-空白组A)/(对照组A-空白组A)×100。

1.2.3 免疫荧光染色 采用10 μg/L TGF-β1处理24 h的HPMCs细胞免疫荧光检测α-SMA和E-cadherin蛋白表达。操作步骤:①取出control组与10 μg/L组的HPMCs细胞,倾去培养基,PBS润洗,4%的多聚甲醛固定5 min,PBS润洗2次,每次3 min;②在含0.1% Triton X-100(24孔板50 μl)的PBS中进行10 min的透膜处理,PBS洗2次,每次5-10 min。手动轻轻晃动数次,吸尽液体;③羊血清用PBS配制成4%羊血清封闭液,室温封闭(24孔板50 μl)30 min;④吸尽液体,勿洗,添加一抗(E-cadherin和α-SMA)(1 ∶200),于37 ℃条件下孵育1 h或放在4 ℃冰箱过夜,PBS洗3次,每次5-10 min;⑤去除一抗后,细胞用PBS洗3次;⑥滴加荧光素标记的二抗,避光,37 ℃,60 min,PBS冲洗,5 min×3次;⑦防淬灭封片剂封片,4 ℃,避光保存;⑧荧光显微镜观察拍照。

1.2.4 DDR1-siRNA细胞转染 根据DDR1基因序列,由广州锐博基因化学技术有限公司设计合成,将DDR1-siRNA及无关片段采用Qiagen Atractene Transgection转染试剂转染至人腹膜间皮细胞中,并分为NC-siRNA组(HPMCs细胞采用转染DDR1-siRNA无关片段)、DDR1-siRNA组(HPMCs细胞转染DDR1-siRNA)、TGF-β1组(10 μg/L TGF-β1处理HPMCs细胞)、TGF-β1+DDR1-siRNA组(10 μg/L TGF-β1处理后的HPMCs细胞转染DDR1-siRNA 24 h),采用real-time PCR及Western blot筛选出可以有效抑制DDR1表达的siRNA片段用于后续实验。

1.2.5 实时荧光定量PCR(RT-PCR) 按照广州锐博公司提供的试剂盒说明书进行操作。引物序列见表1。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequence

名称上游引物 下游引物 DDR15′-CATCTTTACTGCTGCTGCTCTTGG-3′5′-GCACTTGGCAGGATCAAAATGTC-3′β-actin5′-GCACTTGGCAGGATCAAAATGTC-3′5′-GCACTTGGCAGGATCAAAATGTC-3′

1.2.6 Western blot检测蛋白表达 α-SMA和E-cadherin是HPMCs上皮间质转化的关键蛋白。为探究TGF-β1对HPMCs上皮间质转化的影响,我们通过Western blot检测不同浓度的TGF-β1对DDR1、α-SMA和E-cadherin蛋白表达变化。①细胞裂解:收集HPMCs细胞,除去细胞培养基,PBS润洗1-2次,离心得到细胞沉淀物,加入细胞裂解液(1 ∶5)冰上裂解1 h;②蛋白质浓度测定:高速离心机4 ℃,12 000g离心15 min,收集HPMCs细胞上清液,采用BCA法蛋白质浓度定量检测;③凝胶电泳:80 V,30 min后转为120 V,60 min直至溴酚蓝指示电泳至凝胶最底层;④转膜:依据蛋白质指示marker和目的蛋白分子量大小进行切胶,湿转转膜法将目的蛋白转移至PVDF膜上,转膜时长约为2 h;⑤封闭:采用5%的脱脂牛奶室温封闭2 h;⑥孵育一抗:孵育对应一抗(DDR1、E-cadherin和α-SMA)(1 ∶1 000)4 ℃过夜;⑦孵育二抗:按照1 ∶5 000稀释比例,室温条件下孵育对应的二抗约1 h;⑧显影并拍照:摇床摇晃加入TPBS洗涤3次,每次5 min,后加入显影液,显影;显影结果以各目标条带灰度值与内参β-actin条带灰度值的比值表示目标蛋白的相对表达量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 CCK-8检测TGF-β1对HPMCs活力的影响

CCK-8实验结果显示:伴随TGF-β1处理浓度的增加,HPMCs细胞活力显著增加(P<0.05或P<0.01,见图1)。在TGF-β1处理HPMCs浓度为10 μg/L时,细胞活力增加最为显著。

与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01图1 CCK-8检测TGF-β1对HPMCs活力的影响Figure 1 The effect of TGF-β1 on HPMCs activity detected by CCK-8

2.2 Western blot检测TGF-β1对HPMCs上皮间质转化的影响

Western blot检测结果显示:相比于对照组,不同浓度TGF-β1处理组α-SMA显著上调(P<0.01),E-cadherin明显下调(P<0.01,见图2)。因此,在后续实验中采用10 μg/L浓度处理HPMCs。

2.3 免疫荧光检测α-SMA和E-cadherin蛋白表达

免疫荧光检测结果显示,TGF-β1(10 μg/L)处理HPMCs可以上调α-SMA蛋白表达(P<0.01),下调E-cadherin蛋白表达(P<0.01,见图3)。

2.4 RT-PCR和Western blot检测TGF-β1对HPMCs中DDR1 mRNA和蛋白表达的影响

RT-PCR和Western blot检测结果显示:TGF-β1处理可以显著上调DDR1 mRNA和蛋白的表达(P<0.01,见图4)。

与control组比较,**P<0.01图2 TGF-β1对α-SMA和E-cadherin蛋白表达的影响Figure 2 Effect of TGF-β1 on the expression of α-SMA and E-cadherin proteins

与control组比较,**P<0.01图3 免疫荧光检测α-SMA和E-cadherin蛋白表达 (×100)Figure 3 Expression of α-SMA and E-cadherin by immunofluorescence (×100)

与control组比较,**P<0.01图4 DDR1 mRNA和蛋白表达变化Figure 4 expression changes of DDR1 mRNA and protein

2.5 DDR1 siRNA对HPMCs上皮间质转化的影响

Western blot检测结果显示:转染DDR1 siRNA后可以显著抑制DDR1蛋白表达(P<0.01),下调α-SMA的表达,上调E-cadherin的表达(P<0.01,见图5)。

与NC-siRNA组比较,**P<0.01;与TGF-β1组比较，##P<0.01图5 DDR1 siRNA对HPMCs上皮间质转化的影响Figure 5 Effect of DDR1 siRNA on epithelial mesenchymal transformation of HPMCs

3 讨论

腹膜透析是终末期肾病的一种有效性替代疗法,约10%-15%的终末期肾病患者首选该方案进行治疗[12]。伴随慢性肾脏疾病的发病率增加,腹膜透析的患者也越发增多。腹膜纤维化是腹膜透析患者长期的一种病理学变化,其中炎症介质以及TGF-β1是引发腹膜纤维化的重要因素。研究发现,在PD患者的腹膜透析液中TGF-β1的表达水平显著性升高,其表达水平的高低与腹膜恶化的程度呈现正相关[13]。在小鼠动物模型中,通过注射携带TGF-β1基因的腺病毒可诱导小鼠腹膜纤维化[14]。由此可见,TGF-β1在腹膜纤维化中发挥重要作用。对此,本研究前期通过培养HPMCs细胞,外源性TGF-β1(0,5,10 μg/L)处理细胞24 h。CCK-8检测细胞活力发现,伴随TGF-β1处理浓度的提高,细胞活力呈现递增。Western blot检测纤维化相关蛋白结果显示,α-SMA表达上调,E-cadherin表达下调。我们进一步利用免疫荧光检测α-SMA和E-cadherin表达,结果与Western blot结果一致,α-SMA表达上调,E-cadherin表达下调。以上结果共同表明,TGF-β1可诱导HPMCs细胞上皮间质转化过程。但有关其分子作用机制尚不完全清晰。

DDR1是一种新型受体酪氨酸蛋白激酶,广泛参与了组织纤维化进程。其可以与特异性胶原结合进而激活DDR1活性,促进下游信号通路的转导[15]。研究发现,在小鼠的乳腺癌上皮细胞中,基因沉默DDR1可以降低EMT[16]。在结直肠癌细胞系中,过表达DDR1基因可以促进EMT相关蛋白的表达,进而促进结直肠癌的发生发展[17]。在肾脏纤维化中,通过基因敲除DDR1可以降低肾脏TGF-β1表达,缓解肾脏纤维化[18]。以上研究表明,在组织纤维化中,DDR1可能与TGF-β1存在上下游的分子作用关系。为此,我们通过RT-PCR和Western blot检测DDR1表达水平，结果显示,TGF-β1处理组DDR1 mRNA和蛋白的表达均显著性升高。进一步敲低DDR1后检测α-SMA和E-cadherin表达,结果显示,相比于TGF-β1处理组,转染DDR1 siRNA后α-SMA表达显著降低,E-cadherin表达显著性升高。由此表明,在TGF-β1诱导的HPMCs细胞EMT过程中DDR1可能参与纤维化的进程,导致腹膜纤维化。

综上所述,DDR1参与了TGF-β1诱导的HPMCs细胞EMT过程,加快腹膜纤维化的进程。但是,在本研究中未能深入研究DDR1诱导纤维化的下游分子信号通路。因此,在后续的研究中,我们将通过在体动物与体外细胞实验共同研究DDR1介导腹膜纤维化的下游分子机制,进而为靶向抑制DDR1改善腹膜纤维化开拓新的分子机制。