基于Cancer Browser数据库分析HMGA1在肾癌中的表达及预后

刘 伟,周劲松,寇 博

(1西安交通大学医学部第一附属医院血管外科,西安 710061;2西安交通大学医学部基础医学院解剖与组胚系;3西安交通大学医学部第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科;*通讯作者,E-mail:492526094@qq.com;#共同通讯作者,E-mail:zjs301@mail.xjtu.edu.cn)

肾细胞癌是最为常见的泌尿系统恶性肿瘤之一,其在人类所有肿瘤中占据2%-3%[1]。随着诊疗水平的不断提高改善,肾癌患者的生存期逐年提高,但仍有30%的肾癌患者在手术治疗后存在复发转移的风险,近年来靶向治疗在肾癌的治疗中取得不错的疗效,但其仍存在低效性、耐药性等问题[2]。基于此,探寻新的诊疗靶点显得极为重要。

高迁移率族蛋白A1(high mobility group A1,HMGA1)属于高迁移率族蛋白家族中的一员,是一种非组蛋白染色体结合蛋白。有文献报道HMGA1参与并影响细胞进化的进程,如细胞周期的调控、衰老、DNA修复等[3]。其在胚胎组织中的表达较高,而在成熟组织细胞内呈低表达,甚至不表达。研究发现,HMGA1在多种肿瘤中呈现高表达,且与肿瘤的增殖、侵袭转移密切相关[4-6]。本研究基于Cancer Browser数据库,分析HMGA1与肾癌分级分期、上皮间质转化指标以及预后的关系,进而揭示HMGA1基因对肾癌诊疗及预后的潜在应用价值。

1 材料与方法

1.1 数据库分析

从Cancer Browser数据库检索renal cell carcinoma,下载并提取有关肾癌的临床参数资料以及基因表达(TCGA-KIRC-exp-HiSeqV2-2015-02-24),随后检索关键词“HMGA1”,提取并筛选HMGA1在肾癌中的基因表达资料,最后通过GraphPad 8.0软件分析HMGA1与肾癌分级分期、上皮间质转化指标以及预后的关系。

1.2 主要试剂与细胞培养

人肾癌组织及癌旁正常组织、肾小管上皮细胞HK2、肾癌ACHN、Caki、769-P细胞系均由西安交通大学第一附属医院转化医学中心实验室所提供,1640-DF12细胞培养基、胎牛血清均来自美国Gibco公司,单克隆抗体HMGA1、Twist1、Twist2和β-actin购自美国Cell Signaling Technology公司。

正常肾小管上皮细胞HK2和肾癌细胞系均用含10%胎牛血清的1640-DF12培养基培养,培养基内含青霉素(100 U/ml)及链霉素(100 U/ml),细胞置于含5%CO2的37 ℃恒温箱内培养,间隔2 d定期传代换液。

1.3 Western blot检测HMGA1、Twist1、Twist2蛋白的表达

肾癌组织、癌旁正常组织或肾小管上皮细胞HK2、肾癌ACHN、Caki、769-P细胞先用RIPA裂解液充分裂解,随后离心、提取上清液并进行蛋白定量。然后取25 μg变性蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,经转膜、脱脂奶粉封闭后,分别加入HMGA1、Twist1、Twist2和β-actin蛋白一抗(稀释比例均为1 ∶1 000),4 ℃恒温孵育过夜。经TBST液洗脱后,室温下孵育羊抗鼠或者羊抗兔二抗(稀释比例1 ∶1 000)1 h。PVDF膜再次用TBST液洗脱,然后用显影液(美国Bio-Rad公司)显影,通过Image Lab成像软件(美国Bio-Rad公司)进行图像分析。

1.4 统计学分析

选用GraphPad 8.0软件对数据进行汇总分析,用t检验检测两组间的差异表达,并用相关性分析探究HMGA1与肾癌临床相关指标的相关性,然后用Kaplan-Meier检验分析HMGA1表达与肾癌预后的关系,将P<0.05看作差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HMGA1基因表达与肾癌分级分期的相关性

选用Cancer Browser数据库分析HMGA1基因的表达与肾癌grade分级、stage分期的相关性,独立样本的t检验分析及相关性分析显示,HMGA1的基因表达与肾癌的grade分级、stage分期均呈正相关关系(见图1),且Spearman秩相关系数分别为0.307 0,0.179 9,均P<0.000 1。

2.2 HMGA1基因表达与肾癌临床TNM分期的相关性

利用Cancer Browser数据库分析HMGA1基因的表达与肾癌TNM分期的相关性,独立样本的t检验分析及相关性分析显示,HMGA1基因的表达量与肾癌的T分期呈正相关,且T3、T4期肾癌中的HMGA1基因表达是显著高于T1期的(P<0.05和P<0.000 1,见图2)。随后发现HMGA1与肾癌的N和M分期亦表现出正相关关系,且差异具有统计学意义(P<0.001,见图2)。而HMGA1基因与肾癌T、N、M分期相关性的Spearman秩相关系数分别为0.166,0.217 6,0.167 0,均P<0.001。

与G1或stageⅠ比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1图1 利用Cancer Browser数据库分析HMGA1基因表达量与肾癌临床分级、分期的相关性Figure 1 Correlation analysis of HMGA1 gene expression and clinical grade and staging of renal cell carcinoma patients based on Cancer Browser

与T1或N0或M0比较,*P<0.05,***P<0.001,****P<0.000 1图2 利用Cancer Browser数据库分析HMGA1基因的表达量与肾癌TNM分期的相关性Figure 2 The correlation analysis of HMGA1 gene expression and TNM stage of renal cell carcinoma patients based on Cancer Browser

2.3 HMGA1在肾癌中的表达

通过Western blot实验发现肾癌组织中HMGA1的表达高于其在癌旁正常组织内(见图3),且肾癌Caki-1、ACHN细胞系中HMGA1表达亦高于其在正常肾小管上皮细胞HK2内的表达(见图3)。这提示HMGA1在肾癌中呈现异常高表达。

T:肾癌组织;N:癌旁正常组织图3 Western blot检测HMGA1在肾癌组织以及细胞内的表达Figure 3 The protein levels of HMGA1 in the renal cell carcinoma tissues and the cell lines by Western blot

2.4 HMGA1基因表达与肾癌上皮间质转化指标的相关性

利用Cancer Browser数据库检索发现,在肾癌中,HMGA1的基因表达与Twist1无显著相关性,而HMGA1与Twist2的表达呈正相关(见图4A)。随后Western blot实验进一步显示相较于HK2细胞系,肾癌ACHN细胞系中HMGA1与Twist2呈高表达,而两组间的Twist1表达差异无统计学意义(见图4B)。

A.利用Cancer Browser数据库检测HMGA1与Twist1、Twist2在肾癌中表达的相关性 B.Western blot实验检测肾癌细胞内蛋白水平

图4 HMGA1基因表达与肾癌上皮间质转化指标的相关性

Figure 4 Correlation between HMGA1 gene expression and epithelial-mesenchymal transition markers in renal cell carcinoma

2.5 HMGA1表达与肾癌患者预后的关系

随后我们进一步挖掘HMGA1表达与肾癌患者预后的临床资料,分析并绘制了HMGA1高低表达的生存曲线图,结果提示HMGA1高表达的肾癌患者总体生存期显著低于HMGA1低表达组的患者(χ2=7.113,P=0.007 7,见图5)。

图5 HMGA1基因表达与肾癌患者预后的相关性Figure 5 Correlation between HMGA1 gene expression and prognosis of renal cell carcinoma patients

3 讨论

诸多证据显示,HMGA1在乳腺癌、肝癌、结肠癌等多种不同肿瘤中呈高表达,且影响肿瘤的恶性进程[7-9]。文献报道,HMGA1可通过调控c-myc的表达进而促进胃癌的致癌性[4]。也有研究发现,HMGA1在子宫内膜癌中被视作一种潜在的不良预后因子[10]。本研究利用Cancer Browser数据库分析发现,HMGA1的基因表达与肾癌的grade分级、stage分期以及TNM分期呈正相关关系,且差异具有统计学意义。这说明HMGA1在肾癌的恶性进程中扮演着重要角色。

Takaha等[11]学者研究发现,HMGA1在肾癌细胞中呈高表达,且敲低HMGA1可抑制肾癌的克隆形成能力、诱导细胞凋亡以及抑制肾癌的侵袭迁移能力。因此为了进一步验证HMGA1在肾癌中表达,本研究通过Western blot实验发现HMGA1在肾癌组织及部分肾癌细胞系内的蛋白表达显著高于其在癌旁正常组织及肾小管上皮细胞内的表达。这进一步提示HMGA1在肾癌中可能扮演着原癌基因的角色。而近些年有研究报道HMGA1与肿瘤的侵袭转移以及上皮间质转化密切相关。Liu等[12]学者发现HMGA1通过ILK/Akt/GSK3β信号通路促进肝癌细胞的侵袭能力。也有学者发现下调HMGA1可抑制非小细胞肺癌的上皮间质转化过程[6]。本研究利用Cancer Browser数据库分析发现,HMGA1的基因表达与Twist2呈正相关,而与Twist1无明显相关。随后的Western blot实验亦证实,HMGA1与Twist2在肾癌细胞内均呈高表达,而Twist1的表达无明显变化。这进一步提示HMGA1与肾癌的上皮间质转化有着密切关联。而生存分析发现,高表达HMGA1常常提示肾癌患者的不良预后。但HMGA1与其他上皮间质转化指标的关系尚不清楚,且HMGA1对肾癌细胞侵袭迁移、上皮间质转化的作用亦不明确,这都有待于后续体外研究的进一步证实。

总而言之,HMGA1可能是肾癌诊断和预后的一种潜在生物学标志物,后续还需要更多的体内外实验加以证实。