猪MyoG基因外显子1的多态性分析

孙奴奴，刘 瑾

(运城学院 生命科学系，山西 运城 044000)

我国畜牧业中养猪业占主导地位，全国猪肉产量不断地增加，在我国肉类总生产量中占了很大的比例。消费者对猪肉肉质的要求提高，不仅对猪肉的风味、嫩度有要求，对猪肉的营养价值也有更高的要求。国内外对于如何改善猪肉肉质做过大量研究，其中发现可以通过对肌肉生长的调节，改善猪肉品质。而MyoG基因控制肌细胞的增殖与分化，可以增加肌肉的生长速度。肌细胞生成素(MyoG)是生肌调节因子家族中的一员[1]，在生肌调节因子家族中只有MyoG基因可以在所有骨骼肌细胞系中表达，它在胚胎发育中控制中胚层干细胞分化定向形成肌细胞，以促进肌纤维的形成，从而控制肌肉的形成[2]。MyoG基因不仅能对自身基因的表达进行调节，还可以与生肌因子家族中MyoD、Myf-5、Myf-6等基因相互作用，对彼此基因的表达进行调节，调节肌肉中肌球蛋白轻链基因、肌肉肌酸激酶、肌钙蛋白等特异基因的表达。所以肌肉的形成、肉质及产量都受到MyoG基因遗传变异的影响，该基因的遗传变异直接导致肌肉的变异[3]。

国内外相关研究表明MyoG基因调节肌细胞分化成为肌纤维，与肉质的生成有一定的联系。刘梅等用PCR-RFLP技术对申农Ι号猪的MyoG基因的两个多态性位点(3’端和第二内含子内)进行分析，研究发现AA基因型和MN基因型分别为两个位点的优势基因型[4]。在滇南小耳猪MyoG基因多态性分析中发现2041，2047这两个位点的多态性对背膘厚、pH24有显著影响，对瘦肉率有极显著影响；1655，1688这两个位点多态性对瘦肉率和pH24有显著影响，对背膘厚有极显著影响[5]。程广龙等[6]对长淮猪、大淮猪、杜淮猪和淮猪的MyoG基因进行研究，结果显示胴体质量、瘦肉率、眼肌面积等性状与股二头肌的肌纤直径分别呈显著正相关。高勤学等[7]对申农I号猪MyoG基因进行多态性分析，发现具有NN基因型的猪初生重显著高于其他基因型猪，并且具有不同基因型的猪，它的半腱肌和半膜肌的肌纤维密度差异显著，其中NN基因型肌纤维密度高于NM和MM基因型。TePas等[8]用PCR-RFLP技术对MyoG基因的多态性进行了检测，结果显示有3个突变位点：其中，一个是在实验中研究的所有猪种共同特有的，一个是杜洛克猪和长白猪特有的，另一个是梅山猪特有的。实验结果表明猪初生重、肌纤维数与这三个变异位点有一定的关联。Huges等人的研究中发现，MyoD和MyoG基因在肌纤维中的表达不同，MyoD基因在快肌纤维中的表达量比较高，而MyoG基因在慢肌纤维中的表达量比较高。因此，MyoG基因与肉质的风味和嫩度有关联[9]。另外在其他物种的MyoG基因也有类似研究，鸡MyoG基因可以调节肌纤维的形成，对边鸡的生长有影响[10]。对牦牛的MyoG基因进行多态性分析，发现有4个突变位点与牦牛的体高有显著影响[11]。对6个绵羊群体进行多态性分析，发现含有三种基因型，MyoG基因对羊肉的水分和色泽有影响，在水分的表达中BB>AB>AA；在色泽的表达中AB>BB>AA[12]。

本实验选用晋汾白猪和新山西黑猪作为实验动物，采用PCR-SSCP的方法检测MyoG基因多态性并判定基因型，利用统计分析软件计算出基因频率和基因型频率，分析其基因型在两猪种中的分布状况，为研究MyoG基因对晋汾白猪、新山西黑猪肉质影响提供一些材料，为人工选育优良猪种提供依据，对如何生产出优质猪肉有重要指导意义。

1. 材料与方法

1.1 实验动物

本实验选用山西省运城市新龙丰畜牧有限公司提供的40头晋汾白猪和40头新山西黑猪，分别采集两个猪种的猪耳组织1.0g，放入装有75%无水乙醇的离心管中并标号，放入冰盒中带回实验室，在-20℃冰箱保存。

1.2 主要试剂与仪器设备

PCR mix，琼脂糖，溴酚蓝，冰醋酸，EB，甘油，DNA Marker，丙烯酰胺，过硫酸铵，亚甲叉双丙烯酰胺，硼酸，Tris base TEMED等(购自北京华越洋生物工程有限公司)；引物合成(上海生物工程技术服务有限公司)；PCT-200PCR仪(BIO-RAD公司)；DYCZ-28D双板夹芯式垂直电泳仪，DYY-6C恒温恒压电泳仪(北京六一生物科技有限公司)；Tanon-3500数码凝胶图像分析系统(武汉爱斯佩科学仪器有限公司)；TGL-16M高速台式冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 基因组DNA提取及引物合成

使用酚/氯仿/异戊醇/的方法提取猪基因组DNA；根据Genebank发表的猪MyoG基因序列(U14331)并参考郭云雁[13]等人的实验进行设计引物，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3.2 PCR及SSCP

以DNA为模板进行PCR扩增，10微升反应体系为：DNA(0.5微升)，上游引物(0.2微升)，下游引物(0.2微升)，2×Taq PCR Master Mix(5微升)，双蒸水(4.1微升)；PCR反应程序为：预变性95℃，5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，72℃后延伸5min；PCR产物取其中的2微升用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，然后将检测成功的PCR产物，取4微升与6微升6×Loading Buffer混匀，在98℃条件下变性10 min，迅速冰镇10 min后上样，在12%的聚丙烯酰胺凝胶中400 V，预电泳10 min，然后将电压调为200 V，电泳16 h，然后银染20min，显影10～20min；最后利用凝胶成像系统拍照并判别基因型。

1.3.3 数据的统计处理

基因型结果利用PopGen32软件进行群体遗传学分析，并利用SAS8.1统计软件进行卡方检验。

寨卡病毒感染可导致严重的神经系统并发症，开发疫苗保护易感人群至关重要。最近两种DNA疫苗(VRC5288质粒和VRC5283质粒)已进入临床I期试验，通过对最后一次接种4周后的血样分析发现，60%～89%接种VRC5288的受试者及77%～100%接种VRC5283的受试者产生了中和抗体应答，并且该疫苗在试验中具有良好的耐受性及安全性，该试验鼓舞了DNA疫苗的研究，并加快了预防性疫苗的实际应用[41]。

2. 结果与分析

2.1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果

利用晋汾白猪、新山西黑猪的DNA和MyoG引物进行PCR扩增，然后在1.5%的琼脂糖凝胶上点样，对PCR产物进行检测，结果如图1所示。

图1 PCR产物检测结果(注：M为DL20000 maker，1～10为扩增结果)

如图1所示，MyoG基因PCR扩增产物长度为300 bp，条带明亮清晰，没有杂带，可进行后续实验。

2.2 PCR-SSCP结果

用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳对晋汾白猪和新山西黑猪的PCR产物进行SSCP检测，结果如图2和图3所示。

如图2所示，电泳条带比较清晰，MyoG基因在晋汾白猪中存在多态性，基因型为：1～7和11为AB型，8、10为AA型，9为BB型。

如图3所示，电泳条带比较清晰，MyoG基因在新山西黑猪中存在多态性，基因型为：3、4、6、9、11为AB型，5、7、10为AA型，1、2、8为BB型。

图2 晋汾白猪PCR-SSCP结果(注：1～7、11为AB型，8、10为AA型，9为BB型)

图3 新山西黑猪PCR-SSCP结果(注：1、2、8为BB型，3、4、6、9、11为AB型，5、7、10为AA型)

2.3 群体遗传学分析

表1 MyoG基因在两个猪种的基因频率和基因型频率

根据表1结果显示，晋汾白猪中有三种基因型，其中AB有31个，BB有4个，AA有5个；新山西黑猪中有三种基因型，其中AB有27个，BB有8个，AA有5个；在晋汾白猪中A等位基因为优势等位基因，AA基因型为优势基因型。说明AA基因型对于晋汾白猪的进化具有促进作用，在人工选育中具有AA基因型的猪更具有经济效益。新山西黑猪中B等位基因为优势等位基因，BB基因型为优势基因型。说明在新山西黑猪中具有BB基因型的猪种在进化的时候更具有优势，在人工选育中具有BB基因型的猪更具有经济效益。

表2 晋汾白猪、新山西黑猪遗传分析结果

根据表2结果显示，MyoG基因在晋汾白猪中卡方值为11.593389，p值为0.000662；MyoG基因在新山西黑猪中卡方值为4.762568，p值为0.029058，P值均小于0.05，所以在晋汾白猪、新山西黑猪中MyoG基因的多态性位点均不符合Hardy-Weinberg平衡。晋汾白猪的香农指数(0.6928)大于新山西黑猪的香农指数(0.6903)，说明晋汾白猪的遗传多态性高于新山西黑猪。晋汾白猪的遗传纯合度(0.4940)小于新山西黑猪的遗传纯合度(0.4965)，说明新山西黑猪更能稳定遗传。

2.4 基因型分布差异分析

利用SAS8.1分析软件，对MyoG基因在晋汾白猪、新山西黑猪中基因型分布进行检验，结果如表3所示。

表3 两个猪种中MyoG基因型分布差异性检验

根据表3结果显示，χ2值为36.2080，p<0.0001。说明在晋汾白猪和新山西黑猪中MyoG基因型分布差异极显著。

3. 讨论与结论

本实验选用了40头晋汾白猪和40头新山西黑猪作为样本，采用PCR-SSCP的技术对MyoG基因进行多态性分析。结果显示MyoG基因在晋汾白猪中有三种基因型：AB、BB、AA，A基因为优势等位基因，在新山西黑猪中有三种基因型：AB、BB、AA，B基因为优势等位基因。MyoG基因在晋汾白猪中和新山西黑猪中的p值均小于0.05，表明MyoG基因的多态性位点在晋汾白猪、新山西黑猪中都不符合Hardy-Weinberg平衡。对比郭云雁[13]等人的实验，以180头大白猪和170头北京黑猪作为实验动物，在北京黑猪与大白猪中A基因均为优势等位基因，在北京黑猪中基因型AB出现的频率最高，基因型BB出现的频率最低；在大白猪种中纯合基因型AA的频率最高，而BB基因型的频率最低，并且MyoG基因在这两个猪种中都处于Hardy-Weinberg平衡。在王立辛[14]等的实验中选用255头大白猪、390头长白猪、155头杜洛克猪，三个猪种共800头作为实验动物，结果显示在这三个猪种中均存在三种基因型：AB、BB、AA，其中AB出现的频率最高，并且B基因均为优势等位基因。群体遗传学分析结果显示MyoG基因多态性位点在大白猪、长白猪和杜洛克猪中均处于Hardy-Weinberg平衡。

本实验与郭云雁、程笃学和王立辛、苏玉虹等的研究结果相比，基因频率、基因型频率以及Hardy-Weinberg平衡不一致，原因可能有：本实验选用晋汾白猪和新山西黑猪为样本，而郭云雁等人选用了大白猪和北京黑猪，王立辛、苏玉虹等的实验中选用大白猪、长白猪、杜洛克猪作为试验动物，实验中选用的猪种不同，生活的环境、饲养方式、人工选育方法不同，其遗传性能也会有差异；选用的猪品种经过人工选育时人为择优选育也有可能会影响基因型频率，从而影响Hardy-Weinberg平衡。对比郭云雁等人和王立辛、苏玉虹等人的实验，本实验选取的样品数量太少，本实验选取晋汾白猪和新山西黑猪样本各40个，虽符合统计学样本选取的最低要求，但是误差比较大，容易出现特异性。