卵黄抗体提取方法的优化

张曼，柳溪，丛日华，通信作者

卵黄抗体提取方法的优化

张曼1，柳溪2，丛日华2，通信作者

（1. 杨凌职业技术学院，陕西 杨凌 712100；2. 西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100）

近年来，卵黄抗体因不发生交叉反应且特异性强等优点成为了免疫学研究的热点，研究表明，动物经口服用从蛋黄中分离的IgY可以预防或治愈消化系统及呼吸系统相关疾病，但缺乏适用于大批量生产的工业化工艺。现有的纯化方法主要有：沉淀法、层析法与超滤法，3种方法各有优缺点，其中沉淀法是目前最有潜力用于量化生产的方法，但存在效价和得率不能兼顾的缺点。本试验选用经灭活新城疫病毒免疫后的母鸡所产鸡蛋分离得到的卵黄原液，经聚乙二醇浓度梯度提取后测试，结果显示质量浓度为3.5%、8.0%和12.0%时连续纯化效果最佳。此外，经物理分离法分离蛋黄与蛋清，所得卵黄原液中蛋清的残余量几乎为零，消除了蛋清中的蛋白质与脂质对纯化的影响。经过物理分离及3次连续纯化获得的卵黄抗体经BCA试验和SDS-PAGE检测显示，抗体纯度可达80%左右，采用血凝抑制试验进行抗体效价检测，平均滴度可达213。经试验证明，用缓冲液透析后，IgY提取物可以在-20 ℃下储存超过一年。该优化的提纯方法既保证了效价，又保证了产量，且试验流程简洁、成本低廉，为卵黄抗体纯化工业化生产提供参考。

卵黄抗体；蛋白质纯化；聚乙二醇；新城疫病毒；血凝试验与血凝抑制试验

IgY作为一种廉价的多克隆抗体，已有多个报道表明IgY是治疗胃癌[1]、囊性纤维化疾病[2]以及龋齿[3]的一种新方法，并且在预防疾病上也有良好效果[4-7]。在胚胎发育晚期，IgY通过卵黄囊膜转运到胚胎血流中，这种转移类似于哺乳动物的垂直传播。研究表明，IgY从血清转移到蛋黄是受体介导的过程，可发生母体血清抗体选择性转移[8]。鸡蛋里的IgY主要集中在蛋黄中，而IgA和IgM则存在于蛋清中[9]。IgY和IgG之间存在功能相似性，IgY的H链具有1个可变区（VH）和4个恒定区（CH），而IgG仅有3个CH区，但IgY缺乏CH1和CH2结构域之间的铰链区，因此其结构不如IgG灵活，而IgY安全性明显优于哺乳动物IgG，不会引发潜在的危险免疫反应[10-11]。此外，IgY具有比IgG抗体更多的疏水性结构，并且具有更低的等电点[6]，这可保证IgY的稳定性。IgY分子可以在4 ℃保存5～10年且活性没有显著损失，在室温下储存6个月或在37 ℃下储存1个月可以保持活性不变，-20 ℃可长期储存，但在-70 ℃下储存可导致50％的活性损失。据报道[1]，IgY抗体在pH 4和pH 11之间稳定，在较低pH值时活性降低，这可能是由于改变了抗原结合位点的构象，而在碱性条件下至pH 11时稳定，但在pH≥12时失去活性。

目前对IgY的纯化方法主要有：沉淀法、层析法与超滤法，3种方法各有优缺点，其中，沉淀法是目前最有潜力用于量化生产的方法，但沉淀法往往存在效价和得率不能兼顾的情况。因此，本试验拟利用物理分离法和聚乙二醇浓度梯度方法优化卵黄抗体的提取纯度，以期为卵黄抗体纯化工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

1.1.1 材料

鸡卵、磷酸盐缓冲液（PBS）、硫酸铵、聚乙二醇6 000（PEG 6 000）。

1.1.2 仪器

50 mL离心管、量筒、烧杯、漏斗、滤纸、移液枪、卵黄分离器、离心机、500 mL离心瓶。

1.2 方法

1.2.1 卵黄抗体的制备（硫酸铵法）

（1）在无菌条件下，对免疫鸡群所产鸡蛋进行卵黄原液提取，并用PBS溶液进行10倍稀释后等分成10份。

（2）根据硫酸铵饱和度，即10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%，计算达到相应饱和度所需的硫酸铵质量进行配比，并上下颠倒混匀，室温放置15 min。

（3）7 500 r/min离心15 min，观察上清浑浊程度与底部沉淀量，依据上清浑浊且底部沉淀较多的硫酸铵浓度（饱和度X）和上清澄清与底部沉淀较少的硫酸铵浓度（饱和度Y）为原则进行筛选，确定选取30%与50%的硫酸铵浓度。

（4）用PBS对卵黄原液进行等比稀释，加入饱和度为30%的硫酸铵，4 ℃静止1 h。

（5）5 000 r/min 离心20 min，弃去上清。

（6）再用PBS缓冲液溶解沉淀至原IgY体积，加入硫酸铵至饱和度为50%。

（7）5 000 r/min 离心25 min取沉淀。

（8）重复步骤4至步骤7，经2～3遍后可获得IgY纯度较好的卵黄抗体液。

1.2.2 卵黄抗体的制备（聚乙二醇法）

（1）将蛋壳小心地破碎，将蛋黄转移到卵黄分离器中，并尽可能多地去除蛋清。

（2）将蛋黄转移到滤纸上，滚动除去剩余的蛋清，然后用刺血针或移液管尖切割卵黄膜，将蛋黄倒入锥形量筒中，共获取247 mL的卵黄原液。

（3）将蛋黄体积两倍的PBS与蛋黄混合，定容至740 mL，转移至两个离心瓶内，各370 mL，然后分别加入总体积3.5％的PEG 6 000（/，以g计），涡旋混匀10 min。注意观察离心瓶内的液体，该步骤将悬浮液分成两相，即由蛋黄固体和脂肪物质相和含有IgY和其他蛋白质的水相。

（4）将离心瓶在4 ℃下离心20 min（10 000 r/min），将上清液（约250 mL）倒入折叠的滤纸中并转移到新的离心瓶中。

（5）将8％ PEG 6 000 g（根据新体积计算）加入离心瓶中，充分混匀10 min。

（6）将离心瓶在4 ℃下离心20 min（10 000 r/min），弃上清。

（7）使用玻璃棒和涡旋器将沉淀小心地溶解在PBS中，并加入与原始体积量（370 mL）相同的PBS，将溶液与12％PEG 6 000（/，44.4 g）混合，充分混匀10 min。

（8）将离心瓶在4 ℃下离心20 min（10 000 r/min），并将沉淀小心地溶解于PBS中，待气泡消失后，将提取物转移到多个透析胶囊中。

（9）将提取物在0.1％盐水中透析过夜，并使用磁力搅拌器搅拌。第二天早上，用PBS替换盐水再透析3 h。

（10）然后用移液管从透析胶囊中取出IgY提取物并转移到2 mL试管中，每个透析囊中体积约为2 mL。采用BCA试剂盒检测该蛋白含量。将样品等分后，于-20 ℃保存。

2 结果与分析

2.1 浓度梯度测试

本试验对传统聚乙二醇法进行了优化，加入3.5% PEG 6 000离心后，再进行后续浓度梯度提取试验，比较沉淀质量，结果如表1所示。可以看出在PEG 6 000质量浓度为8%时沉淀出现了峰值，但沉淀的颜色仍为淡橙色，说明还有大量杂蛋白未除去，这时可再一次使用浓度为12%的PEG 6 000进行纯化沉淀，可以观测到此次的沉淀为纯白色，且体积稍有下降。

表1 PEG浓度梯度测试结果

浓度5%6%7%8%9%10%11% w/v 质量/g3.4145.6776.1827.2566.9105.9364.859

2.2 物理分离

在多次重复试验操作中发现，如果第一次离心获得的上清浑浊，最终获得的沉淀固体质量也会大幅减少。经试验发现，卵黄原液中的蛋清和卵黄膜残留均可影响上清的澄清度，因为蛋清与卵黄膜含有与卵黄截然不同的脂质与蛋白质，卵黄抗体也与之存在着不同程度的亲和度，可显著影响IgY从液相中萃取的效果。在本试验中增加了步骤1与步骤2，利用滤纸吸附了残余的蛋清，并且使卵黄膜也黏着在滤纸上，去除了约99%的蛋清与卵黄膜，从而解决了上清浑浊的问题。

2.3 温度测试

温度对双水相的形成有着重要的影响，主要是由于低温会影响聚乙二醇的溶解度，从而影响双水相的形成，如在4 ℃条件下进行试验操作则无法形成双水相。所以本研究尽量避免直接使用从冰箱中取出的鸡蛋，或使用冷藏过的磷酸盐缓冲液（PBS）进行稀释，以避免沉淀中出现PEG 6 000的晶体残余。

2.4 效价检测

对获得的IgY抗体进行血凝抑制试验检测，检测结果如表2所示。

表2 三次血凝抑制试验结果

样本第一次第二次第三次 Polson法沉淀后样品282829 3.5%PEG沉淀后样品215215215 8.0%PEG沉淀后样品214214214 12.0%PEG沉淀后样品214213213

结果表明，优化后的方法可大幅提高IgY样品的效价，原始方法的效价滴度仅为29，而优化过的方案可达到213。此外，根据血凝抑制试验（表2）结果发现，在纯化过程中IgY的效价会有一定程度的下降，但每次纯化下降的幅度仅为1个滴度左右，获得的成品滴度在213左右。通常制作疫苗的抗体滴度要求为26，如果使用2 mL的提取原液生产规格为2 mL的疫苗，则可制作128支滴度为26的疫苗，效果十分理想。

2.5 BCA试验

根据标准曲线计算实际浓度，得表3。

表3 BCA试验结果

样本吸光度浓度（μg/μL） 3.5％PEG沉淀后的样品1.26316.607 8.0％PEG沉淀后的样品1.01012.979 12.0％PEG沉淀后的样品0.477 5.365 12.0％PEG沉淀透析后的样品0.414 4.467

BCA试验结果表明，在纯化过程中总蛋白含量在不断下降，特别是加入12.0%的PEG 6 000离心沉淀后，浓度下降了一倍多，但结合血凝抑制试验的结果可以发现IgY抗体的效价并没有在这一步下降，说明纯化除去的蛋白质中大部分是其他无关的蛋白，也表明了利用该方法可获得纯度较高的IgY卵黄抗体。

2.6 SDS-PAGE

分别用蛋黄原液、3.5％PEG沉淀后的样品、8.0％PEG沉淀后的样品、12.0％PEG沉淀后的样品及透析后的样品进行SDS-PAGE凝胶电泳试验，结果如图1所示。SDS-PAGE结果表明，获得的IgY分子结构正确，在65和27 kDa处分别有一条明显的条带，即HC-重链与LC-轻链，而35至45 kDa的条带可能是卵黄蛋白原II前体的C-末端片段。在使用3.5％PEG沉淀后，可根据条带大小不同，洗脱时增加PEG浓度至8.0％以及12.0％时，非特异性条带完全消失。对于一些较小的蛋白，仍可采用透析法进行进一步去除。

图1 SDS-PAGE

注：泳道1为Marker，泳道2为蛋黄原液，泳道3为3.5％PEG沉淀后的样品，泳道4为8％PEG沉淀后的样品，泳道5为12％PEG沉淀后的样品，泳道6为透析后样品。IgY-HC≈65 kDa，LC≈27 kDa

3 讨论

禽的免疫系统主要由胸腺和法氏囊介导的细胞免疫和体液免疫组成，当受到抗原刺激时，由法氏囊产生的B细胞可分化成浆细胞，可分泌特异性的抗体，这些抗体经过血液循环运送至机体各部位，当循环至卵巢时，特异性抗体在卵细胞中积累，继而形成卵黄抗体。由特异抗原获得的卵黄抗体在免疫动物时，这些抗体可与细胞膜结合，改变细胞表位，抑制或减少相应病原菌与细胞的接触，降低病毒病或细菌病的发生。此外，虽然IgY与IgG性质相似，但IgY比较稳定，可在机体内维持较长的时间，增加抗体的免疫效果，因此，在禁止使用抗生素的时期，卵黄抗体成为部分人类或动物疾病预防或治疗的最佳替补物质。通过给鸡进行免疫注射后，对所产鸡蛋进行分离卵黄提取抗体，用于疾病的预防和治疗[12-15]。

IgY虽然在数量方面无法与IgG单克隆抗体相比，但其具有IgG所不具有的独特性质，如不激活哺乳动物补体系统，与HAMA（人抗小鼠抗体）、类风湿因子或人血型抗原没有交叉反应性，增加了使用IgY的安全性[16-17]。此外，由于鸡和哺乳动物遗传距离较远，且免疫系统存在差异，有助于提高抗体的特异性，因此与兔相比，鸡更易产生抗哺乳动物蛋白的抗体。而且，如果用相同的哺乳动物抗原对鸡和兔进行免疫，鸡通常会比兔具有更强的特异性。此外，从动物福利角度看，IgY具有另外一个独特的优势，即抗体是从蛋黄中非入侵性提取，对母鸡本身并不造成任何伤害。

量化提纯方式是阻碍IgY生产的重要阻力之一，传统的硫酸铵纯化法虽然是经典的蛋白质纯化方案，但因卵黄中脂类含量较高而不适用，虽然残余的硫酸铵更易从最终的样品中被去除（通过透析），但如果坚持用硫酸铵法进行沉淀，则必须使用接近实际生产量的体积测定饱和度（X）与饱和度（Y），这势必会产生大量的资源浪费。

本研究成功优化了一种可获得高质量IgY且经济实惠的提取方法。BCA检测和SDS-PAGE分析均显示该方法所获的IgY具有较高的纯度，避免了蛋清蛋白或卵黄膜对卵黄抗体的影响。此外，经过HI检测发现最终获得的抗体具有高达213的稳定滴度，所以，无论是制作疫苗还是生产其他药品，该提取物都可作为优质的原料。但目前如果要进行工业化生产，除大容量离心机外，大批量蛋黄与蛋清的分离会是一个亟待解决的问题，如果分离不完全会大大降低IgY的提取效率，若使用人工分离，耗时耗力。

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Method optimization of IgY antibody extraction

ZHANG Man1, LIU Xi2, CONG Ri-hua2, Corresponding Author

（1. Yangling Vocational & Technical College, Yangling 712100, Shaanxi Province, China; 2. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi Province, China）

In recent years, yolk antibody has become a hot research in immunology due to their no cross reaction and strong specificity. Studies have shown that IgY isolated from egg yolk can prevent or cure digestive or respiratory-related diseases, but there is still lack of industrial processes suitable for mass production. The existing purification methods are mainly divided into precipitation, chromatography and ultrafiltration method, with their own advantages and disadvantages. Among them, precipitation method is the most potential method to be applied in quantitative production; however, the precipitation method often cannot achieve both potency and yield. In this study, the yolk stock solution isolated from eggs produced by hens immunized with inactivated Newcastle disease virus was selected and tested by polyethylene glycol concentration gradient extraction. The results showed that the continuous purification of 3.5%, 8.0% and 12.0% were the best. In addition, the obtained yolk stock solution was almost without egg white after the separation of egg yolk and egg white by physical separation method, which eliminated the effects of protein and lipid in egg white on purification. The yolk antibody obtained through physical separation and three consecutive purification can reach purity of about 80% by BCA and SDS-PAGE tests, and the average titer was 213using a hemagglutination inhibition test. And this study showed that IgY extract can be stored at -20 ℃ for more than one year after dialysis with buffer. The present study showed that the optimized purification method guarantees both potency and yield, and the test process is simple and of low cost, which lays the foundation for the research and development of industrialized production method of yolk antibody purification.

IgY; protein purification; polyethylene gly; avian pneumo-encephalitis virus; blood coagulation test and hemagglutination inhibition test

1008-5394（2020）02-0056-05

10.19640/j.cnki.jtau.2020.02.013

S852.4

A

2019-11-06

杨凌职业技术学院院内科研项目（A2016042）

张曼（1979-），女，副教授，博士，主要从事家禽疫病防控技术研究。E-mail：1647864117@qq.com。

丛日华（1973-），男，副教授，博士，主要从事动物生理基础方面的研究。E-mail：crihua1232@163.com。

责任编辑：张爱婷