巴西龟弗氏柠檬酸杆菌病的临床症状及组织病理观察

罗福丽，牛宇宸，胡秀彩，吕爱军，通信作者，叶明皓，孙敬锋

巴西龟弗氏柠檬酸杆菌病的临床症状及组织病理观察

罗福丽1，牛宇宸2，胡秀彩1，吕爱军1，通信作者，叶明皓1，孙敬锋1

（1. 天津农学院 水产学院 天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384；2. 天津大学 化工学院，天津 300072）

为观察巴西龟弗氏柠檬酸杆菌病的临床症状及其组织病理学特征，采用人工感染试验、石蜡切片和HE染色方法进行组织病理研究。结果表明，感染发病龟主要表现为眼结膜发炎、口鼻皮肤溃烂，解剖可见肺部发黑，肠道淡黄色，无内容物、水样黏液增多等临床症状；组织病理学观察显示眼睑上皮组织色素细胞增多，胃和肠上皮细胞变性、坏死、脱落，心脏心肌纤维间隙变宽、坏死且有大量炎性细胞浸润，肺脏肺泡细胞与血管内皮细胞界限不清、肺泡壁毛细血管淤血，肝脏肝细胞坏死、中央静脉淤血、肝细胞索紊乱，肾脏肾小管上皮细胞坏死，肾小球出血，肌肉肌纤维间隙有大量炎性细胞浸润。以上结果为阐明龟类弗氏柠檬酸杆菌病的致病机理提供一定参考。

巴西龟；弗氏柠檬酸杆菌病；组织病理

巴西龟（）又被称为“红耳龟”，原产于美国中部至墨西哥北部，在我国分布范围非常广泛，具有药用、观赏、食用等价值，而且该物种食性杂、疾病少，容易饲养，深得人们喜爱[1]。近年来，随着巴西龟集约化养殖规模扩大，疾病频繁发生，其中，细菌性疾病报道较多[2-5]。陶池有[2]研究表明患细菌性肠道出血症的金钱龟（）有肠壁大量血斑、口鼻出血等临床症状。吴季森等[3]报道龟摩根氏变形杆菌（）病主要表现为口腔、鼻孔有白沫流出。陶锦华等[4]报道感染肺炎克雷伯氏菌（）的黄喉拟水龟（）鼻、眼部位有较多分泌物，严重者双目失明。最近，叶明皓等[5]从患病巴西龟眼部分离出雷氏普罗威登斯菌（），病龟有眼结膜充血、发炎等临床症状。已有报道指出龟类细菌性疾病发生快、分布广、危害大，给龟类养殖产业造成了较大的经济损失[6]。

近几年，关于龟鳖类弗氏柠檬酸杆菌（）病的细菌鉴定及病例报道备受关注[7-12]。国内学者报道中华鳖（）感染弗氏柠檬酸杆菌病主要表现为败血症[7-8]，也有报道指出中华鳖腮腺炎继发感染弗氏柠檬酸杆菌[9]。Chiacchio等[10]从巴西龟的泄殖腔中分离出弗氏柠檬酸杆菌，结果表明该菌具有很强的致病性。国外学者已有对弗氏柠檬酸杆菌感染绿海龟（）导致血管炎、结肠炎等[11-12]的研究报道。但是，关于龟类弗氏柠檬酸杆菌病组织病理学及其致病机制的研究，目前尚未见文献报道。本试验对人工感染巴西龟弗氏柠檬酸杆菌病的临床症状、剖检病变及组织病理学进行观察研究，以期为该病的致病机理提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试剂

健康巴西龟（体重约10.0 g）购自天津市某宠物龟养殖场，在室温下饲养观察7 d，健康无病后用于人工回感染试验。弗氏柠檬酸杆菌TC-1菌株，由天津农学院水产学院、天津市水产生态及养殖重点实验室从天津市某养殖场送检患病巴西龟中分离、鉴定、保存。

1.2 人工回感染试验

参照康雪微等[13]的方法，随机选取健康巴西龟作为试验动物，分为感染组和对照组，每组10只，采用人工腹腔注射法对感染组龟注射TC-1菌液100 μL，其含菌量为2.4×108cfu/mL，对照组龟注射无菌生理盐水100 μL。饲养温度约为26±1℃，连续观察28 d，记录感染龟的发病死亡情况。

1.3 临床症状与剖检观察

对感染发病死亡的巴西龟进行临床症状及解剖观察，无菌操作将龟裙边缘剪开，打开背甲，观察其内脏器官的病变情况，记录病龟的主要临床症状和内脏器官的病理变化特征。

1.4 组织切片制备与观察

参照叶明皓等[5]的方法进行，在无菌操作下取发病巴西龟的肝脏、肾脏、心脏、肠道、眼睑皮肤、胃、肺、肌肉组织小块，放入无菌生理盐水中浸泡5 min左右，再用波恩试液固定8～12 h。然后用70%酒精浸泡1.5 h，用1-6级的叔丁醇脱水各2 h，液蜡保存。使用石蜡切片技术，苏木素-伊红（H-E）染色，风干后用正置荧光显微镜观察、拍照记录。

2 结果

2.1 人工感染巴西龟临床症状

采用弗氏柠檬酸杆菌TC-1菌株进行人工腹腔注射感染巴西龟试验，结果表明巴西龟在3 d后出现发病、死亡现象，在感染28 d时累计死亡率达60%；患病巴西龟的临床症状主要表现为反应迟钝、精神不振，食欲减退甚至停止摄食，个别龟肌肉松弛，眼睛结膜发炎、肿大、黏液增多、闭眼，口鼻皮肤溃烂、呼吸困难等，发病后期身体瘦弱衰竭而死（图1A）；解剖病死龟体腔内有恶臭气味、腹水浑浊、肺脏发黑、肠道无内容物、肠壁失去弹性、含有大量淡黄色黏液等症状（图1B）。

图1 人工感染发病巴西龟

注：A图中感染发病龟眼结膜发炎（箭头）；B图中感染发病龟肺脏发黑

2.2 感染巴西龟组织病理变化

对感染巴西龟进行组织病理学观察，可见胃组织黏膜上皮细胞脱落、坏死，疏松结缔组织间有炎性细胞浸润（图2A）；肠道黏膜层上皮细胞严重变性、坏死、脱落，肠绒毛破裂，固有层的淋巴组织和毛细血管坏死，固有层和黏膜层结构不完整，黏膜下层结缔组织变性、坏死，内环、外纵两层平滑肌间隙增宽，浆膜与肌层间隙增宽（图2B）；心脏组织中心肌纤维间隙增大、排列紊乱、断裂、坏死、变性，纤维间有大量炎性细胞浸润（图2C）；肺脏中支气管分支末端的囊状结构不清晰，单层肺泡细胞与血管内皮细胞界限不清，肺泡壁毛细血管淤血（图2D）；肝细胞间界限不清、细胞坏死，肝细胞索紊乱，中央静脉淤血（图2E）；肾脏组织中肾小管上皮细胞坏死，肾小球出血（图2F）；眼睑上皮组织色素细胞增多，多边形细胞减少，表皮层与真皮层的间隙增大（图2G）；肌肉组织肌纤维间隙增大，有大量炎性细胞浸润（图2H）。

图2 感染巴西龟组织病理染色观察

注：A图中胃黏膜上皮细胞坏死、脱落（向左箭头），右下角为其放大图；B图中肠道黏膜上皮细胞坏死、脱落（向下箭头），结缔组织变性（向右箭头），平滑肌间隙增宽、坏死（向上箭头），固有层的淋巴组织和毛细血管坏死（向左箭头），右下角为其放大图；C图中心脏心肌纤维变性、坏死（向右箭头），心肌纤维间隙有炎性细胞浸润（向左箭头）；D图中肺脏肺泡细胞与内皮细胞的界限不清（向上箭头），肺泡壁毛细血管淤血（向右箭头）；E图中肝脏肝细胞部分坏死（向右箭头），中央静脉淤血（向左箭头）；F图中肾脏肾小球坏死（向右箭头）、出血（向左箭头）；G图中眼睑上皮组织色素细胞增多（向右箭头），多边形细胞减少（向左箭头），右下角为其放大图，部分表皮层与真皮层的间隙增宽（向上箭头）；H图中肌肉肌纤维间隙增宽（向右箭头），大量炎性细胞浸润（向左箭头）

3 讨论

弗氏柠檬酸杆菌是肠杆菌科（Enterobacteriaceae）柠檬酸杆菌属（）的代表菌，是一种条件致病菌，该菌是动物和人肠道内的正常菌群，普遍分布于土壤、水、食物等自然环境中[14]。该菌作为“人-兽-鱼”共患病的病原菌，不仅对人类健康造成一定的威胁，导致腹泻、食物中毒、继发感染等[15-17]，而且对水产动物也有很强的致病性，弗氏柠檬酸杆菌曾引起中华鳖、中华绒螯蟹（）和红螯螯虾（）致病，主要症状表现为出血、败血症 等[18-20]。该菌引起的疾病感染率和死亡率高，极大降低了龟鳖养殖业的经济效益，是该行业当前急需解决的新型问题之一。

研究表明，龟鳖类弗氏柠檬酸杆菌病主要表现为反应迟钝、精神不振、不摄食，眼结膜发炎，腮腺发炎肿大，腹甲出血、背甲糜烂，肝脏呈土黄色或肝脏肿大，肾脏肿大、充血、发炎，肠道出血、有血色腹水、气味腥臭、黏膜脱落等临床症状[7-9]。本研究中，感染弗氏柠檬酸杆菌的患病巴西龟主要临床症状与上述研究相似，且病龟还表现为肺脏发黑、肠道淡黄色，病情严重时，口鼻皮肤溃烂等。

龟鳖类柠檬酸杆菌病的发病原因多为条件性致病[21-22]。章剑等[21]发现柠檬酸杆菌导致多种池龟败血性皮肤溃疡病的发生可能与生活环境差、皮肤破损等饲养管理有关。Jackson等[22]认为沙雷铁氏菌（）、柠檬酸杆菌继发感染可能参与溃疡病的发病过程。关于龟鳖类弗氏柠檬酸杆菌病组织病理学方面的研究，目前尚未见文献报道。Fernandez等[23]报道新生柯氏喙鲸（）感染弗氏柠檬酸杆菌败血症，其肺脏的组织病理显示肺组织淤血，支气管上皮细胞坏死、脱落等症状。梁利国[24]报道感染弗氏柠檬酸杆菌的三疣梭子蟹（）的组织病理学研究，结果显示病蟹心肌纤维断裂，肌肉组织变性、肌细胞溶解等。舒新华等[25]对费氏柠檬酸杆菌感染乌鳢（）腹水病病理形态学进行研究，结果显示胃和肠道都有黏膜上皮细胞脱落、固有层毛细血管充血、炎性细胞浸润等病理变化。研究表明，柯氏喙鲸[23]、三疣梭子蟹[24]、乌鳢[25]、银鲶鱼（）[26]、珍珠魟（）[27]等水产动物感染弗氏柠檬酸杆菌病以败血症为主要临床症状，这与本试验观察发病巴西龟症状和病理变化基本一致，主要表现为肺脏、肾脏、肝脏、肌肉等组织器官中都出现淤血、炎性细胞浸润和出血现象。此外，病龟的眼睑上皮组织色素细胞增多，多边形细胞减少，对应的临床症状是眼结膜发炎、浑浊，眼睛肿大、黏液增多、无法睁眼，这与龟鳖类的白眼病有类似症状[28]，值得进一步研究。

4 结论

本研究对人工感染巴西龟弗氏柠檬酸杆菌病的临床观察及其组织病理学进行研究。结果表明，感染发病龟主要表现为眼结膜发炎、肺部发黑、肠道淡黄色等临床症状；进行病龟组织病理学观察显示，眼睑、胃、肠、心脏和肺脏等均有不同程度的组织病变。以上研究结果为阐明龟类弗氏柠檬酸杆菌病的致病机理提供了一定参考。

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Clinical signs and histochemical observation ofdisease in turtle（）

LUO Fu-li1, NIU Yu-chen2, HU Xiu-cai1, LÜ Ai-jun1,Corresponding Author, YE Ming-hao1, SUN Jing-feng1

（1. Tianjin Key Laboratory of Aqua-Ecology and Aquaculture, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2.School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China）

In order to observe the clinical signs and its histopathological characteristics ofdisease in turtle, Histopathology was studied by artificial infection test, paraffin section and HE staining. The results showed that the main clinical signs of the infected sick turtle were conjunctivitis of the eye, ulceration of the oral and nasal skin; anatomy showed that the lungs were black, the intestinal tract was yellowish, with no content, and the water-like mucus increased. Histopathological observation showed the increase of pigment cells in eyelid epithelium, degeneration, necrosis and exfoliation of gastric and intestinal epithelial cells. The myocardial fibrils were widened, necrotic, and infiltrated with numerous inflammatory cells in the heart tissue. The boundary between pulmonary alveolar cells and vascular endothelial cells was unclear, and the alveolar wall had capillary congestion with Liver cell necrosis, central venous congestion, hepatic cord disorder, renal tubular epithelial cell necrosis, and glomerular hemorrhage. There was a large amount of inflammatory cell infiltration in muscle fiber space. The above results can provide some reference for elucidating the pathogenic mechanism ofdisease of turtle.

;disease; tissue pathology

1008-5394（2020）02-0044-04

10.19640/j.cnki.jtau.2020.02.010

S947.9

A

2019-05-23

国家大学生创新训练计划项目（201810061036）；天津市自然科学基金项目（18JCYBJC29900）；天津市水产产业技术体系创新团队（ITTFRS2017009）；天津农学院综投平台项目（J01009030638）；天津市水产生态及养殖重点实验室开放基金（TJAE201803）

罗福丽（1995-），女，硕士在读，主要从事水产动物微生物与免疫学研究。E-mail：1838684865@qq.com。

吕爱军（1973-），男，教授，博士，主要从事水产动物微生物与免疫学研究。E-mail：lajand@126.com。

责任编辑：张爱婷