HPVDNA分型联合KRAS、Ki-67检测对宫颈癌的诊断价值

武丽蕊，王兰朋，李红霞，刘勃

1河北中石油中心医院妇科，河北 廊坊065000

2廊坊市人民医院胸外科，河北 廊坊065000

宫颈癌的发病率居女性全部恶性肿瘤的第1位，严重威胁女性的身体健康，宫颈癌的防治是临床关注的热点。研究显示，宫颈癌患者多伴有人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染，其发病与患者持续的HPV感染状态有关。目前已经确定的HPV分型有100多种，其中40多种与宫颈感染有关[1-2]。HPV可分为高危型和低危型，多数临床检测发现，高危型HPV更容易引起宫颈癌，但是尚存在较大的争议。HPV DNA分型检测可以区分HPV分型，确定患者为哪类HPV感染，有助于进一步阐明HPV感染与宫颈癌的关系[1-3]。v-Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）可以调节细胞生长，与卵巢癌、肺癌的发生有关[4]。Ki-67是一类增殖细胞核抗原，与乳腺癌、肺癌等多种肿瘤的增殖和预后不良有关[5]。本研究探讨了HPV DNA分型联合KRAS、Ki-67检测对宫颈癌的诊断价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年1月至2018年12月河北中石油中心医院收治的宫颈癌患者作为观察组。纳入标准：①经病理检查确诊为宫颈癌；②已婚女性，有性生活；③神志清楚，沟通能力良好。排除标准：①合并其他部位肿瘤；②合并其他严重脏器疾病；②合并感染性疾病或免疫系统疾病。依据纳入和排除标准，本研究共纳入86例宫颈癌患者。另选择同期体检的90例宫颈炎患者为对照组。观察组患者的年龄为35～67岁，平均（43.25±7.46）岁。对照组患者的年龄为36～65岁，平均（42.7±7.32）岁。两组患者的年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 HPV DNA分型检测

两组患者均于月经干净后3～7天进行检测，采样前3天避免性生活、阴道冲洗及阴道用药等。使用无菌宫颈刷采集患者宫颈口分泌物，然后将宫颈刷折断置于细胞保存液中，4℃保存。采用微生物DNA提取试剂盒提取宫颈分泌物DNA，严格按照操作步骤进行。使用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）-反向点杂交方法，采用HPV基因分型试剂盒检测HPV，包括15种高危型HPV和6种低危型HPV。

1.3 免疫组织化学染色方法

采用免疫组织化学染色方法检测KRAS和Ki-67的表达情况，具体步骤如下：病灶组织切除后，使用无菌生理盐水冲洗组织上面的血液、黏液等，立即使用4%多聚甲醛固定；固定24 h后将组织取出，逐步进行石蜡包埋、切片等；将石蜡切片进行二甲苯、梯度乙醇水化；流水冲洗后，将组织切片浸没于柠檬酸钠抗原修复液中，37℃条件下在微波炉内加热6 min，共4次，修复切片抗原，每加热6 min检查液面，避免干片现象发生；将切片置于室温下自然冷却，然后使用流水冲洗抗原修复液，再使用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗；应用内源性生物素封闭切片中的内源性过氧化物酶；PBS清洗后，使用山羊血清封闭10 min，直接将KRAS和Ki-67一抗孵育在切片上，置于4℃冰箱中过夜；采用PBS冲洗切片上的一抗，室温下孵育二抗60 min；PBS冲洗二抗，使用二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，并在显微镜下观察，待切片出现棕黄色后使用流水冲洗，终止反应；将切片置于苏木精内复染3 min，流水冲洗，盐酸乙醇分化，返蓝后，将切片脱水；使用二甲苯透明，中性树胶封片，晾干[6]。

1.4 观察指标及评价标准

比较两组患者的HPV DNA阳性率，分析两组患者的HPV DNA分型。分析KRAS、Ki-67、HPV DNA分型及三者联合检测诊断宫颈癌的灵敏度、特异度及准确度。KRAS、Ki-67阳性表达位于细胞质或细胞核，采用高倍显微镜观察免疫组织化学染色结果。依据阳性细胞比例评分：0～10%为0分，11%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～100%为3分；依据染色程度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕色为3分。阳性细胞比例评分与染色程度评分相加，0分为阴性（-），1～2分为弱阳性（+），3～4分为中度阳性（++），＞4分为强阳性（+++）[5-6]。

1.5 统计学分析

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验，等级资料的比较采用秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV DNA阳性率的比较

观察组患者的HPV DNA阳性率为97.67%（84/86），高于对照组的14.44%（13/90），差异有统计学意义（χ2=123.649，P＜0.05）。

2.2 两组患者的HPV DNA分型

观察组患者的HPV DNA分型以高危型病毒HPV16、HPV18为主，对照组患者的HPV DNA分型以低危型病毒HPV6、HPV11为主。（表1）

表1 两组患者的HPV DNA分型[ n（%）]*

2.3 KRAS和Ki-67表达情况的比较

两组患者的KRAS和Ki-67表达情况比较，差异均有统计学意义（u=3.837、8.239，P＜0.05）；其中观察组患者的KRAS和Ki-67阳性率均为100%，分别高于对照组的35.56%（32/90）和16.67%（15/90），差异均有统计学意义（χ2=5.396、4.241，P＜0.05）。（表2）

表2 两组患者的KRAS和Ki-67表达情况

2.4 HPV DNA分型联合KRAS、Ki-67检测对宫颈癌的诊断价值

HPV DNA分型联合KRAS、Ki-67检测诊断宫颈癌的特异度和准确度均高于任一单独检测方法。（表 3）

表3 不同检测方法对宫颈癌的诊断价值

3 讨论

近年来，宫颈癌的发病呈年轻化趋势，早期发现并进行治疗能够明显降低患者的死亡率，对改善患者预后具有重要意义。研究显示，宫颈癌的发病与长期持续感染HPV有关，特别是高危型HPV患者发生宫颈癌的可能性更大，因此，发生高危型HPV感染的患者应增加宫颈病变检查次数，注意宫颈病变的发生状况[7-9]。HPV DNA分型检测能够明确患者感染HPV的类型，了解哪种HPV感染容易引起宫颈癌，进而重点预防，为宫颈癌的早期发现提供依据[10-11]。KRAS基因是Ras家族成员，位于12号染色体上，具有编码KRAS蛋白的功能，能够调控细胞的生长，而当人体发生病变时，它能够促进细胞持续生长，甚至导致基因突变，进一步引起细胞内信号转导异常，致使细胞持续增殖发生癌变[11-12]。Ki-67是细胞增殖的重要标志物，在细胞分裂的不同时期均有表达，与肿瘤的发生、转移有关[13-14]。

本研究对86例宫颈癌患者和90例宫颈炎患者进行了HPV DNA分型及KRAS、Ki-67检测，结果显示，宫颈癌患者的HPV阳性率高于宫颈炎患者，提示HPV感染与宫颈癌的发生具有密切关系，与以往文献报道结果一致[7,15]，充分显示了HPV感染是患者发生宫颈癌的危险因素。本研究结果显示，宫颈癌患者感染HPV以HPV16和HPV18等高危型为主，而宫颈炎患者感染HPV以HPV6和HPV11等低危型为主，提示高危型HPV16、HPV18感染的患者更易发生宫颈癌。本研究表明，宫颈癌患者的KRAS、Ki-67阳性率均高于宫颈炎患者，提示宫颈癌患者由于发生病变导致KRAS、Ki-67表达水平升高，这两个指标可作为宫颈癌辅助诊断的工具[16-19]。本研究结果还显示，HPV DNA分型联合KRAS、Ki-67检测诊断宫颈癌的特异度和准确度均高于任一单独检测方法，进一步说明这些指标可为早期预防宫颈癌提供可靠的依据。然而本研究由于病例选择有限、研究时间短等因素，未对宫颈癌及宫颈炎患者进行分级，下一步将会更加深入详细地探讨宫颈癌的发生及发展机制，为临床治疗提供更多依据。

综上所述，宫颈癌患者的HPV阳性率及KRAS、Ki-67阳性率均较高，宫颈癌患者感染HPV以高危型HPV16和HPV18为主，且HPV DNA分型联合KRAS、Ki-67检测对宫颈癌的诊断效能较高。