n-3多不饱和脂肪酸对克罗恩病大鼠模型的干预效果及肠道微生态菌群的影响*

丛龙玲，姚嘉茵，吕永慧△，胡邦，詹原泉

1 广州医科大学附属中医医院脾胃科 广东广州 510130

2 中山大学附属第六医院消化内科 广东广州 510655

3 中山大学附属第六医院肛肠外科 广东广州 510655

克罗恩病（Crohn’s disease，CD）是一种可以累及全消化道的肠道慢性炎症，具有缓解期与活动期交替反复发作的特点。慢性炎症不断进展会导致穿孔、肠瘘、腹腔脓肿及肠梗阻等并发症，37%～61%的CD患者在确诊后10年内因为出现并发症而需要接受一次或以上的手术治疗[1]。目前，CD的发病机制不明确，有观点认为CD是在易感人群遗传背景下发生的与感染密切相关的肠道免疫功能紊乱[2]，缺乏有效治疗药物。近期对CD的研究[3]更关注于饮食以及肠道微生态菌群在CD发病机制中的作用。作者团队既往研究已证实，n-3多不饱和脂肪酸（n-3 polyunsaturated fatty acid，n-3PUFA）要素饮食可有效改善三硝基苯磺酸（trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS）诱导的CD大鼠模型的肠组织病理学改变，下调血清炎性因子表达水平，对CD大鼠有确切的治疗作用[4]，但关于n-3PUFA对大鼠动物模型肠道微生态菌群的影响尚未明确。因此，本研究拟使用HLAB27转基因大鼠（以下简称B27大鼠）作为CD动物模型，HLA-B7转基因大鼠作为对照组，采用n-3PUFA作为干预治疗，探讨n-3PUFA饮食对CD肠道微生态的影响，以及与CD疾病活动和炎性因子表达变化的关系，以期为研发有效且低毒副作用的CD治疗用药提供一定的动物实验依据，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

本研究采用HLA-B7转基因大鼠（B7大鼠，n=8）以及HLA-B27转基因大鼠（B27大鼠，n=16），所有转基因大鼠均购自中山大学动物实验中心，体重180～220 g。饲养在25℃室温，相对湿度55%±10%，昼夜12 h/12 h环境下，所有大鼠自由摄水。B27大鼠表达人主要组织相容性复合体Ⅰ类HLAB27基因及相关的人β2-微球蛋白基因，出现全胃肠道炎症，作为模型大鼠。B7大鼠不出现肠道炎症，作为对照。B27大鼠随机分为模型组与治疗组，故大鼠分组如下：空白对照组（B7，n=8）；模型组（B27，n=8）以及治疗组（B27+n-3PUFA，n=8）。治疗组通过灌胃方式给予n-3PUFA饮食干预，干预时间为2周，每天灌胃一次。根据公式：大鼠有效干预剂量=（X mg/kg×70 kg×0.018）/0.2 kg，即6.3X mg/kg，其中X代表人的有效干预剂量，换算大鼠干预剂量得20 mg/（kg· d）[5]。

1.2 大鼠疾病活动指数评分

每日记录各组大鼠的一般资料，包括大便情况、体重变化。根据疾病活动指数（disease activity index，DAI）[6]评估各组大鼠肠炎疾病活动度。体重下降（分值：无=0；1%～5%=1；6%～10%=2；11%～15%=3；＞15%=4）、粪便性状（分值：正常=0；半稀便=2；稀便=4）、大便隐血（分值：阴性=0；阳性=2；肉眼血便=4）三项评分相加为DAI评分，评分越高提示疾病活动度越高。

1.3 大鼠结肠组织大体形态损伤及组织学损伤指数评分

实验结束时，麻醉大鼠后处死，取新鲜结肠组织，观察大体损伤情况，评估结肠组织大体形态损伤指数 （colon macroscopic damage index，CMDI），分值如下[5]：正常=0；局部黏膜充血水肿=1；线性溃疡=2；线性溃疡+黏膜炎症=3；2个以上部位出现线性溃疡=4；纵型溃疡长度＞1 cm=5；溃疡长度＞2 cm=6～8。

结肠组织经过固定、包埋、切片、HE染色后显微镜下观察，评估组织学损伤指数（tissue damage index，TDI）[6]，分值如下：无损伤=0；黏膜及黏膜下炎症浸润/轻度糜烂=1；1分基础上病变范围＞50%=2；溃疡延伸至黏膜下层和黏膜肌层=3；3分基础上病变范围＞50%=4；细胞坏死达黏膜固有基层=5；5分基础上病变范围＞50%=6。

1.4 ELISA检测各组大鼠血清炎性因子表达水平

实验结束时，大鼠麻醉后心脏穿刺取血（2～3 mL），离心（2 000 r/min×5 min）后得血清，进行ELISA（试剂盒购自美国invitrogen公司）检测。实验过程按照试剂盒说明书进行。检测的因子包括促炎因子（IL-17、IL-2）以及抑炎因子（IL-10、IL-4）。

1.5 16S rRNA基因组检测粪便微生态状况

留取新鲜粪便，均匀混匀后取样，置于灭菌离心管中（样品＞20 g/样），液氮速冻，-80℃存放。使用2-250-bp末端配对reads对16S rRNA基因的V4区域进行扩增和测序（MiSeq，Illumina，Essex，UK）。利用UPARSE在97%相似度下进行聚类，得到OTU（operational taxonomic units，操作分类单元）的代表序列；使用usearch_global方法将所有Tags比对回OTU代表序列，得到每个样品在每个OTU的丰度统计表，通过RDP classifer（v2.2）软件将OTU代表序列与数据库比对进行物种注释，置信度阈值设置为0.8，完成OTU的物种分类。本研究采用Chao指数和Shannon指数进行α多样性（Alpha diversity）分析。采用Bray-Curtis指数进行β多样性（Beta diversity）分析，应用基于Bray-Curtis进行非度量多维尺度法（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）对比样本组之间差异。

1.6 统计学分析

应用SPSS 22.0（IBM公司，美国）软件进行统计学处理。符合正态分布的计量资料采用（±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两组间比较采用Bonferroni检验；符合偏态分布的计量资料采用M（QL，QU）表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis非参数检验，两两组间比较采用Kruskal-Wallis Oneway ANOVA（k samples）检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组DAI、CMDI、TDI评分

B27大鼠的DAI评分高于B7大鼠（P＜0.05），采用n-3PUFA干预后，B27大鼠DAI评分有下降趋势。进一步采用量表评估大体组织损伤程度以及镜下病变程度，结果提示B27大鼠存在明显的肠组织器官损伤（P＜0.05），采用n-3PUFA干预后，镜下损伤得以改善（P＜0.05）。见表1、图1。

表1 各组DAI、CMDI以及TDI评分 分，M（QL，QU）

图1 各组大鼠结肠病理学所见（HE）

2.2 各组炎性因子的表达水平

与B7组大鼠比较，B27组大鼠促炎因子（IL-17、IL-2）表达升高，抑炎因子（IL-10、IL-4）表达下降（均P＜0.05），提示B27大鼠存在炎性因子的表达失衡。采用n-3PUFA干预后，可抑制B27大鼠促炎因子的表达，促进抑炎因子的表达（均P＜0.05）。见表2。

表2 各组炎性因子的表达水平 pg/mL，±s

表2 各组炎性因子的表达水平 pg/mL，±s

*与B7组比较，P＜0.05；#与B27组比较，P＜0.05。

指标IL-17 IL-2 IL-10 IL-4 B7 32.6±11.4 13.9±8.6 22.4±7.1 71.8±11.0 B27 73.5±11.2*42.4±17.5*11.9±7.7*30.3±6.4*B27+n-3PUFA 39.3±16.7#18.0±8.0#21.8±3.2#46.6±8.8#*

2.3 n-3PUFA干预后对B27大鼠粪便微生态菌群的影响

已知B27大鼠肠道微生物菌群的表型与CD相似，采用n-3PUFA干预B27大鼠模型，在干预前后留取大鼠新鲜粪便，行16S rRNA测序，并进一步完成α多样性（Chao指数和Shannon指数，图2A、图2B）分析以及β多样性（基于Bray-Curtis进行NMDS分析，图2C）分析，结果提示n-3PUFA治疗后B27大鼠粪便菌群的丰富性以及多样性增加。

图2 n-3PUFA干预前后对HLA-B27大鼠粪便微生态菌群的影响

3 讨论

HLA-B27大鼠是一种自发出现包括回肠在内的全消化道慢性炎症动物模型，其肠道微生态菌群的改变类似CD患者的改变[7]。因此，该动物模型目前主要用于肠道微生态菌群研究。本研究中使用HLAB27大鼠作为CD模型大鼠，鉴于HLA-B7大鼠不会出现肠道炎症[8]，故作为对照组。

要素饮食是治疗CD的重要手段。临床上对于合并肠瘘、肠梗阻等并发症的CD、难治性CD或者儿童CD患者，使用全肠内营养支持治疗（exclusive enteral nutrition，EEN），可以有效促进黏膜愈合，降低手术率[9]。其机理可能与减少饮食摄入的食物抗原，从而减轻肠道免疫反应相关。脂肪酸是人体重要的必需营养素，其中n-3PUFA被报道具有抗炎、抗氧化的作用。我们前期研究已证实n-3PUFA可有效治疗TNBS诱导的CD大鼠[4]，但是n-3PUFA对B27大鼠的干预作用和对微生物生态群落的影响却未知。本研究结果提示，n-3PUFA可有效改善B27大鼠结肠组织学病理，但对大体病变及临床活动度的治疗作用不明显，这可能和饮食干预时间有限相关。

免疫紊乱一直是CD致病机制研究中的焦点，炎性指标的表达可以反映免疫反应水平。在免疫相关性疾病（比如强直性脊柱炎[10]和系统性红斑狼疮[11]等）中炎性指标出现表达失衡，表现为促炎因子表达增加，抑炎因子表达减少。本研究结果提示B27大鼠血清中促炎因子（IL-17、IL-2）表达增加，抑炎因子（IL-10、IL-4）表达减少，肠道慢性炎症持续反应导致器官损伤。n-3PUFA干预后有效纠正炎性因子失衡，提示n-3PUFA一定程度上可减轻肠道免疫反应。

肠道微生态中包括1 000～1 150种细菌，1014个总细胞数，占据人体总微生物的78%，由此认为肠道微生态本身就是一个复杂的微生物系统，甚至是一个具有多种功能的微器官[12]。肠道微生态与人类多种疾病息息相关，比如肥胖症等代谢性疾病、CD等免疫性疾病等[13]。2016年Ianiro等[14]在Gut杂志报道，CD患者肠道菌群多样性下降，各细菌菌属丰度改变，包括变形菌门（Proteobacteria）增加，厚壁菌门（Fir⁃micutes）减少，拟杆菌属（Bacteroides）、优杆菌属（Eubacterium）和乳杆菌属（Lactobacillus）等有益菌群显著减少，机会致病菌属增加。2017年Halfvarson等[15]发现不同IBD亚型的肠道微生物组特点不同，均与健康人群有显著差异，此外，CD相关的遗传风险变异将影响肠道微生物菌群。粪菌移植（fecal micro⁃biota transplantation，FMT）通过改变肠微生态菌群可以安全有效治疗CD患者的复发性艰难梭菌感染[16-17]。因此，微生态菌群在CD致病中起重要作用，致力于研究并且阻断CD致病中的微生态改变，有可能成为治疗CD的有效手段。本研究结果提示，n-3PUFA可以增加B27大鼠肠道微生态的丰富性以及多样性，这可能是n-3PUFA治疗克罗恩病大鼠的机制之一。

本研究验证了n-3PUFA饮食对B27大鼠的治疗作用，这可能与维持炎性因子平衡、保护肠微生态丰富性与多样性相关。往后需要更多的研究进一步明确是否有特定的微生态菌属在CD致病中起作用，以及从细胞层面深入研究要素饮食、免疫及微生态之间的密切联系。