快速提取石蜡组织中结核分枝杆菌DNA 方法体系的建立及评估

彭学勤 崔园园 褚明亮

1.贵州省人民医院，贵州 贵阳550002；2.新乡医学院第一附属医院，河南 卫辉453100；3.贵州中医药大学第一附属医院，贵州贵阳550000

Chelex-100 是一种由二乙烯苯、苯乙烯共聚体组成的化学螯合树脂，其悬液在碱性环境（pH10～11）和100℃的条件下，可导致细胞膜的破裂和DNA 的变性并释放出来［1-2］，同时Chelex-100 含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，对高价金属离子有很高的亲和力和螯合作用，从而防止DNA 在高温下降解，并且Chelex-100 还能结合许多可能影响下一步PCR 分析的其他外源物质［1］。由于具有这些优点，Chelex-100 提取DNA具有高效、经济、快速等优势，特别是当检材或含有的目的基因DNA 较少时，可以用Chelex-100 提取方法提取DNA［3-5］。

随着分子病理学的发展，越来越多的病理检测项目需要从石蜡组织中提取基因组DNA，包括结核分枝杆菌DNA［6］。从石蜡组织中提取结核分枝杆菌DNA的方法虽然多种多样，但有的过程繁琐复杂，有的成本太高，有的提取效率不高［6-8］，Chelex-100 用于提取石蜡组织中的结核分枝杆菌DNA 还没有报道。本研究利用Chelex-100 作为基质，一步法提取石蜡组织中的结核分枝杆菌DNA，建立从石蜡组织中高效快速提取结核分枝杆菌DNA 的方法。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选取贵州省人民医院2019 年6～7 月临床确诊为结核病例的石蜡组织58 例（其中抗酸染色阳性标本11 例，抗酸染色阴性标本47 例）。

1.2 试剂与仪器 商业化的石蜡组织DNA 提取试剂盒（厦门艾德生物公司，FFPE DNA），结核分枝杆菌核酸扩增PCR 荧光检测试剂盒（中山大学达安基因公司），Chelex-100（Sigma 公司），十二烷基硫酸钠（SDS，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），吐温-20（Tween-20，碧云天生物技术公司），乙基苯基聚乙二醇（NP-40，碧云天生物技术公司），荧光PCR 仪（安捷伦公司，Mx3000P）。

1.3 试剂盒提取结核分枝杆菌DNA 按照FFPE DNA提取试剂盒说明书，提取石蜡组织中的总的基因组DNA（包括了组织DNA 和结核分枝杆菌DNA）。

1.4 Chelex-100 为基质的试剂配比 15%Chelex-100（w/v），0.1%SDS（w/v），1%Tween-20（v/v），1%NP-40（v/v），去离子水，混匀备用。

1.5 Chelex-100 为基质的试剂提取结核分枝杆菌DNA石蜡切片5μm，切3～4 张，放入1.5mL EP 管中，加入1mL 二甲苯涡旋混匀，12 000g 离心30s，弃去二甲苯，再重复上述过程一次。随后加入1mL 无水乙醇涡旋混匀，12 000g 离心30s，弃去无水乙醇，再重复上述过程一次。将上述EP 管放入56℃金属浴中1～2min，再用移液器吸取剩余的残留液体（融化的残留石蜡及无水乙醇混合物）。每个管中加入200～300μL 的完全混匀的Chelex-100 为基质的试剂，涡旋，100℃金属浴中15min。冷却至室温后，12 000g 离心5min，取上清液（即提取到的DNA 溶液）备用。

1.6 PCR 扩增 取上述2 种方法提取到的DNA 溶液4μL 作PCR 扩增。反应条件：93℃2min 预变性；93℃45s，55℃60s，10 个循环；然后，93℃30s，55℃45s，35 个循环。在55℃45s 时收集FAM 通道荧光信号。扩增结束后进行数据分析，得出结果。

1.7 统计学分析 采用SPSS13.0 处理数据，计数资料采用配对χ2检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。判断两种提取方法的一致性，采用Kappa 检验，其中Kappa＞0.75 视为有高度一致性。

2 结果

在11 例抗酸染色阳性标本中，Chelex-100 为基质的试剂提取的DNA 和商业化试剂盒提取的DNA进行结核分枝杆菌PCR 验证，结果显示两种提取方法的阳性率都是100%。在47 例抗酸染色阴性标本中，Chelex-100 为基质的试剂提取的DNA 和商业化试剂盒提取的DNA 进行结核分枝杆菌PCR 验证，结果显示商业化试剂盒法的阳性率为40%（19/47），Chelex-100 法的阳性率为38%（18/47）。58 例标本，发现两种提取方法均阳性的标本为28 例；两种提取方法均为阴性的标本为27 例；经Kappa 一致性检验，Kappa 值为0.897，提示两种提取方法有非常高的一致性。

表1 抗酸标本中两种提取方法PCR 结果比较

3 讨论

结核病是严重威胁人类健康的重要传染性疾病之一，病理学诊断是微生物学之外最重要的结核病确诊途径［9］。抗酸染色是病理学中诊断结核病最常用的特殊染色方法，然而抗酸染色诊断阳性率一般较低，抗酸阴性不能否定结核杆菌的存在［10］。近年来，随着分子生物学技术的快速发展，分子PCR 诊断技术在结核病的诊断中起到越来越重要的作用［7-10］。但遗憾的是，由于病理科检测的量相对检验科较少，所以商业化开发的结核PCR 试剂的适应范围并没有涵盖到特殊的石蜡病理标本，病理科都是在摸索中优化不同的实验条件，特别是前期的提取石蜡组织标本DNA 的步骤，适用于后续的分子病理PCR 检测［6，11-12］，但是以上实验中DNA 提取的方法不同程度的存在时间较长或试剂价格昂贵等问题。Lamballerie 等［2］研究了Chelex-100试剂提取不同种类细菌DNA 的最适浓度，结果发现10%～15%的Chelex-100（w/v）和0.1%SDS（w/v），1%Tween-20（v/v），1%NP-40（v/v）组成的混合试剂对结核杆菌DNA 有快速提取效果。但是迄今为止，还没有关于是否可以应用Chelex-100 快速提取石蜡标本中结核DNA 的报道，因此本实验对此进行了研究。应用Chelex-100 为基质的混合试剂提取到的DNA 的PCR 结果和商业化试剂盒的结果无显著性差异。并且与商品化的提取试剂盒相比，Chelex-100 法提取过程均在一个EP 管内进行，可以减少操作上可能的失误，避免污染。由于临床活检小标本越来越多，Chelex-100 法的另一个优势是需要的检材标本用量可以很少。另外，相对于商品化提取试剂盒来说，Chelex-100 提取成本更经济。

综上所述，Chelex-100 提取石蜡组织中结核杆菌基因组DNA 是一种快速、经济、有效的方法。值得临床推广。