奶牛分娩后早期血浆代谢物变化研究

张萌 罗芳 王敏 武彦泽 王俊奎 和东迁 陈丽尧 陶金忠

（1. 宁夏大学农学院，银川 750021；2. 内蒙古圣牧控股有限公司，巴彦淖尔 015000；3. 宁夏上陵牧业有限公司，青铜峡 751600）

围产期是从产前3周到产后3周，这个阶段奶牛机体代谢发生巨大的变化［1］。主要体现在随着分娩的临近，奶牛干物质的摄入不能满足自身能量消耗，从而导致奶牛负能量平衡（Negative energy balance，NEB）［2］。NEB 损害奶牛的健康和影响生产，并导致免疫力下降［3］。当奶牛发生NEB时通常引起脂肪肝和酮病［4］，而这两种疾病均能造成肝功能的损伤［5-6］。肝脏是能量代谢的主要器官，奶牛体内的糖代谢主要来自于肝脏糖异生［7］。天冬氨酸（Aspartic acid，ASP）、组氨酸、蛋氨酸、脯氨酸和丝氨酸的浓度在患有酮症的奶牛中下降［8］。这些氨基酸的浓度降低，因为它们在糖异生过程中被大量使用［9-10］。而在分娩后的几天内，乳腺对葡萄糖、氨基酸和脂肪的需求量成倍增加，肝脏糖异生和脂肪动员的速度大大加快［11-12］。因此，奶牛分娩后血浆代谢物发生显著变化，影响奶牛的健康。代谢组学是一种高通量、高灵敏度的现代分析技术。目前，代谢组学方法已成功地应用于奶牛产后血浆生物标志物的筛选［13］。

为此，本研究通过对分娩当天和产后第7天血浆代谢组学研究，探究分娩后早期奶牛血浆代谢物的变化情况，探讨分娩后血液代谢组变化，旨为了解分娩后血浆代谢物变化对奶牛健康状况提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验仪器和设备 超高效液相：1290 UHPLC（美国Agilent公司）；高分辨质谱1：QTOF 6550（美国Agilent公司）；高分辨质谱2：Triple TOF 6 600（AB Sciex）；天平：BSA124S-CW（Sartorius）；研磨仪：JXFSTPRP-24（上海净信科技有限公司）；超声仪：PS-60AL（深圳市雷德邦电子有限公司）；纯水仪：明澈D24 UV（Merck Millipore）；色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm 2.1×100 mm（Waters）。

1.1.2 试验材料和试剂 醋酸铵（CNW Technologies）；乙腈（CNW Technologies）；氨水（CNW Technologies）；甲醇（CNW Technologies）；L-2-氯苯丙氨酸（上海恒柏生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 试验动物分组和血液的采集保存 在宁夏某大型集约化奶牛场，选择15头2-3胎、预产期和体况相近（体况评分BCS 3.0-3.5）的健康荷斯坦奶牛，奶牛奶产量（分娩当天由于采集初乳无法统计）和胎次的均值±SD，见表1。分别在分娩当天（A组）和产后第7天（B组）晨饲前（5：00-6：00）尾静脉采集血液10 mL，使用肝素钠抗凝，并以3 000 r/min离心10 min进行分离，收集上层血浆于冷冻管中，标记后置于-80℃冰箱冷冻保存，以备后续分析。

表1 奶牛奶产量和胎次

1.2.2 检测方法

1.2.2.1 代谢物提取 参照张萌等［14］的代谢物提取方法。

1.2.2.2 上机检测 使用的色谱柱为购自Waters的UPLC BEH Amide 色谱柱（1.7 μm×2.1×100 mm）。进样体积为2 μL。按照表2中的流动相参数在安捷伦1290超高效液相控制下进行分析。

表2 液相色谱流动相条件

控制软件（Analyst TF 1.7，AB Sciex）控制下AB 6600 Triple TOF & Agilent 6550 QTOF质谱仪基于IDA功能进行一级、二级质谱数据采集。每个数据循环采集中，筛选出强度最强且大于100的分子离子进行采集对应的二级质谱数据。轰击能量：30 eV，每50 ms15张二级谱图。ESI离子源参数设置如下：温度：650℃，辅助气压：60 Psi，气帘气压：35 Psi，雾化气压（GS1）：60 Psi，喷雾电压：5 000 V（正离子模式）或-4 000 V（负离子模式）。

1.2.3 数据处理 原始数据经ProteoWizard软件处理，将数据转换成mzXML格式。采用XCMS程序对转化后数据进行峰对齐、提取峰面积和峰积分等处理工作。检查数据的完整性和缺失值状况，补充或删除数据中的极值和数据中组内缺失值大于50%的离子峰。内标校正和归一化处理数据，使得代谢物之间和各样本之间均可以进行平行比较。

1.2.4 统计学分析 使用SIMCA软件对处理后数据进行模式识别和Pareto-scaling预处理。对处理后数据进行多元统计分析，无监督主成分分析（Principal component analysis，PCA），正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）。构建表达模型，并对模型中的数据进行置换检验（Permutation test），计算根据OPLSDA模型得到变量投影重要度（Variable importance in the projection，VIP）。对数据进行单变量统计分析包括：变异倍数（Fold change，FC）和Students t-test分析。

1.2.5 差异代谢物鉴定和生物学信息学分析 经过多元统计分析得到VIP大于1的值，用产后第7天均值比上分娩当天均值得到FC值，结合P值。以VIP>1初步筛选出各组间的差异物，单变量统计分析P<0.05和FC>1.3或FC<0.77进一步筛选显著性差异代谢物。显著性差异代谢物使用Origin 8.0进行ROC Curve分析得到AUC面积大于0.8的代谢物。将筛选出的显著性差异代谢物在线分析平台MetaboAnalyst进行聚类分析和代谢通路分析。

2 结果

2.1 代谢谱分析

由图1可知，QC样本TIC出峰保留时间和峰面积都重叠很好，表明在整个实验过程中仪器稳定性很好。由图2可知，QC样本相关性越接近于1，说明整个方法稳定性越好数据质量越高。QC样本相关性很高，表明数据质量很高。

2.2 多元统计学分析、

由图3可知，对分娩当天（A组）和产后第7天（B组）的PCA分析，观察所有样本之间的总体分布趋势，表明正、负离子模式数据下A组和B组有一定的分离趋势。由图4可知，建立A组和B组的OPLS-DA模型，得到的模型评价参数正离子模式R2Y=0.959和负离子模式R2Y=0.973。R2越接近1表明模型越稳定可靠，本试验正负离子均R2Y≥0.95，表明模型稳定可靠。由图5可知，显示了基于正、负离子模式数据两组OPLS-DA模型的置换检验图，正、负离子模式数据置换检验截距，分别是Q2=-

0.340（正离子模式）和Q2=-0.329（负离子模式）。Q2intercept<0说明本试验正、负离子模式数据建立的OPLS-DA模型均未发生过度拟合。

2.3 差异代谢物的筛选

以 VIP>1、P<0.05、FC>1.3或FC<0.77进一步筛选显著性差异代谢物。分娩当天和产后第7天两组共筛选出17种显著性代谢物。正离子模式下筛选出9个显著性差异代谢物，其中4个代谢物产后第7天显著低于分娩当天组，5个代谢物产后第7天显著高于分娩当天组（P<0.05）。负离子模式下筛选出8个显著性差异代谢物，其中2个代谢物产后第7天显著低于分娩当天组，6个代谢物产后第7天显著高于分娩当天组（P<0.05）。正、负离子模式下鉴定出的差异代谢物见表3。

2.4 生物信息学分析和生物标记物筛选

利用ROC曲线对显著性差异代谢物进行分析筛选，考察这些显著性差异代谢物的分类识别能力。当ROC曲线下的面积（Area under curve，AUC）大于0.5识别能力较好，AUC值越接近于1，识别效果越好。如图6，结果显示A组和B组共有11个代谢物AUC面积在0.8以上。筛选出11个代谢物产后第7天比分娩当天全部上调：磷脂酰胆碱（16∶0/16∶0）、二醇胆酸、脯氨酸-丝氨酸、脯氨酸-甘氨酸、1-硬脂酰基-sn-甘油3-磷酸胆碱、乳清、L-天冬氨酸、N-乙酰基-L-天冬氨酸、异戊酰甘氨酸、L-肉碱和苯甲酸。

利用MetaboAnalyst分析平台对ROC曲线筛选出的显著性差异代谢物进行聚类分析和KEGG代谢通路分析。图7显示了正负离子模式A组和B组显著性差异代谢物层次聚类结果。结果发现同组样品很好聚类在同一簇中，聚在同一簇内的代谢物具有相似的表达模式，表明筛选的显著性差异代谢物合理且准确。由图8可知，A组和B组两组11个显著性差异代谢物共参与11种不同代谢通路。11个代谢通路分别是：丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢、亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢、精氨酸生物合成、组氨酸代谢、泛酸和CoA生物合成、β-丙氨酸代谢、甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢、嘧啶代谢和氨基酰基-tRNA生物合成。主要代谢通路以影响力大于0.2（Pathway impact>0.2）为筛选标准，Pathway impact>0.2代谢通路丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢。甘油磷脂代谢和嘧啶代谢两组影响力相对较小（Pathway impact>0.05）。

图1 QC样本TIC图

图2 正离子和负离子QC样本相关性分析

3 讨论

3.1 丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢

N-乙酰 -L-天冬氨酸（N-acetyl-aspartic acid，NAA）是存在于哺乳动物大脑中的游离氨基酸［15］，在线粒体由游离ASP乙酰化以乙酰辅酶A（CoA）为辅助因子合成［16］。NAA被认为是多种神经系统疾病的生物标志物［17］。ASP是一种重要的非必需氨基酸，主要参与尿素循环、糖异生和苹果酸-天门冬氨酸穿梭等多种生化过程［18］。这些生化过程主要发生在肝脏，当ASP含量降低时导致氨积累，且引起肝脏损伤［19-20］。ASP含量的增加表明通过糖异生等过程产生的能量增加［19］。ASP的乙酰化可以促进其从线粒体中去除，有利于谷氨酸转化为酮戊二酸，从而进入三羧酸循环进行能量生产［16］。有研究表明丙氨酸、ASP和谷氨酸代谢在淋巴细胞再生和免疫过程中起着重要作用［21］。在本研究中NAA和ASP在产后第7天相对分娩当天上调，可能是在丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢中参与能量代谢，维持分娩后泌乳需要大量的能量。这可能是为了增加机体能量的产生，减轻对肝脏的影响，维持奶牛分娩后的机体健康。

图3 A组和B组两两比较正、负离子模式下PCA图谱

3.2 甘油磷脂代谢

图4 A组和B组两两比较正、负离子模式下OPLS-DA图谱

图5 A组和B组正、负离子模式下OPLS-DA模型置换检验图

表3 A组和B组正、负离子模式下鉴定的差异代谢物

磷 脂 酰 胆 碱（Phosphatidyl cholines，PC） 是细胞膜的主要磷脂成分和生产脂质第二信使的底物［22］，也是肝脏三酰甘油（Triacylglyceride，TAG）分泌所必需的甘油磷脂［23］。PC主要参与甘油磷脂代谢，甘油磷脂是比较复杂的代谢，代谢中主要有PC和磷脂酰乙醇胺（PE）两种甘油磷脂［24］。而PE转化为PC是肝脏特异性的PC合成途径［25］。PC是促进肝脏中极低密度脂蛋白（Very low density lipoprotein，VLDL）转运甘油三酯必需的物质［26］。血液中PC水平的升高会导致奶牛肝脏中VLDL的分泌增加［27］。从妊娠到哺乳期血浆PC减少与产后脂肪肝的发展有关［28］。血浆中PC从泌乳早期到泌乳后期增加了10倍［29］。奶牛血浆中PC的浓度从分娩前2周开始下降，分娩后开始上升到第4周达到高浓度［30］。有研究表明PC可以作为产后奶牛脂肪肝血浆脂质评价生物标志物［31］。本研究从分娩当天到产后第7天血浆PC浓度升高，与前人研究结果一致。说明分娩后PC浓度增加，使得奶牛肝脏中VLDL的分泌增加，增强了TAG从肝脏中转运出来的速度，降低了产后奶牛患脂肪肝的几率，降低了奶牛分娩后负能量平衡的发生机率。

图6 11个显著性差异代谢物的ROC曲线

图7 A组和B组显著性差异代谢物聚类热图

图8 A组和B组差异代谢物的代谢通路分析

3.3 嘧啶代谢

乳清酸（Orotic acid，OA）是核酸碱基的前体，也是嘧啶合成的中间体。OA的多少与奶牛的来源、饮食和泌乳期有关［32］。比较泌乳奶牛和非泌乳奶牛乳腺组织表达时发现，OA是奶牛泌乳关键代谢产物，泌乳组奶牛OA显著高于非泌乳组奶牛［33］。OA的再循环通常可以在肝脏中发生，肝细胞将其吸收并转化为尿苷，用于嘧啶循环途径［34］。嘧啶核苷酸合成的最后一步将OA转化为有活性的尿酶［35］。当肾脏受到严重损害时，尿酶活性较低［36］。本研究产后第7天OA相比分娩当天浓度上调，增加的OA可能是和泌乳密切相关，升高的OA可能在嘧啶代谢中转化为尿酶，从而降低对肾脏损伤，有利于维持奶牛分娩后机体健康。

4 结论

本研究通过分析分娩当天和产后第7天奶牛血浆代谢物，发现产后第7天与分娩当天相比NAA、天冬氨酸、PC和OA上调。这些代谢物变化有利维持奶牛分娩后机体健康。