脂肪干细胞对于同种异体脂肪移植免疫排斥反应的抑制作用

高长春，张雪松，崔 磊，周晨笑，商 婷，梁顺涛

1.佳木斯大学临床医学院，黑龙江 佳木斯 154000；2.北京首都医科大学附属世纪坛医院中心实验室，北京 100000

在同种异体脂肪移植的手术当中存在着移植后出现大量的移植组织坏死情况，脂肪移植技术的开展已有100多年的历史，因其手术操作方便、充盈外形好等优点而深受整形外科医师的重视［1］，在同种自体的脂肪移植当中虽无免疫排斥反应但在异体脂肪移植当中存在着以免疫排斥反应为主的等情况影响着脂肪移植手术后移植脂肪组织的成活率［2］。由于受体与供体之间不同的免疫系统，移植术后会出现以T细胞为主的急性免疫排斥反应与慢性排斥反应，从而引发多种T细胞与B细胞介导的细胞免疫应答以及体液免疫应答，影响着术后移植组织的成活率［3］。研究表明，脂肪干细胞可通过旁分泌的机制对免疫排斥反应产生抑制作用［4-9］。而在特定浓度的透明质酸凝胶当中，脂肪干细胞将会聚集成为不易流散的球体［10-11］。本文旨在研究脂肪干细胞对于同种异体脂肪移植当中的免疫排斥反应的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料

PBS（phosphate buffer saline）缓冲液（Eallbio公司，中国）、胎牛血清（Sciencell，美国）、DMEM（dulbecco's modified eaglemedium）低糖培养基（Eallbio公司，中国）、胰蛋白酶（Eallbio公司，中国）、Ⅰ型胶原酶（Worthington，中国）、HE（苏木精-伊红）染色试剂盒（雷根公司，中国）、BODIPY染色试剂盒（Invitrogen公司，美国）、脂周蛋白抗原（中杉金桥公司，中国）、免疫荧光染色封片剂（中杉金桥公司，中国）。

1.2 动物实验分组

设30只C57BL/6J小鼠和10只BAL/BC小鼠作为实验对象，其中10只BAL/BC小鼠作为异体脂肪移植的供体提供移植所需的脂肪组织，10只C57BL/6J小鼠作为脂肪干细胞细胞的提供者，10只C57BL/6J小鼠作为对照组，移植过程无脂肪干细胞参与，10只C57BL/6J小鼠作为实验

组，移植过程中加入自体脂肪干细胞干预。

1.3 C57BL/6J小鼠的脂肪干细胞提取与扩增

处死6周龄大的C57BL/6J小鼠后，提取其腹股沟部的脂肪组织剪碎并加入PBS，以1 200 g离心3分钟后加入0.1%Ⅰ型胶原酶放置于37℃，80 g摇床50分钟，然后以2 000 g离心15分钟，吸弃上清，将沉淀放置于培养皿中，加入混有胎牛血清的DMEM低糖培养基。放入参数为37℃，浓度10%的CO2培养箱当中培养。吸弃培养皿当中的上清液，使用PBS缓冲液洗去残余胎牛血清，加入1 m l胰蛋白酶消化脂肪干细胞，等待细胞悬浮后加入胎牛血清终止消化，以1 500 g离心5分钟后，均匀分开放入多个培养皿当中进行扩增。

1.4 脂肪干细胞成球实验

经相关资料［10-11］得知，在10%浓度的透明质酸凝胶当中，脂肪干细胞将会获得最佳的成球效果。所以将扩增后的C5BL/6J的1ml的2×106数量的脂肪干细胞单细胞悬液滴于1 ml的20%透明质酸凝胶中，12小时后，得到包含1×106/ml成球脂肪干细胞的浓度为10%的透明质酸凝胶（图1A）。

1.5 同种异体脂肪移植手术

处死6周龄大的供体BAL/BC小鼠后，提取其腹股沟部的脂肪组织，剪碎（图1B）。与含有成球C57BL/6J小鼠脂肪干细胞均匀混合（图1C）。采用1m l注射器吸取移植液体备用（图1D）。将受体C57BL/6J小鼠进行腹腔内注射浓度为5%的水合氯醛进行麻醉，等待完全麻醉，由于小鼠的头部皮下组织紧密，异于其他部位的皮肤于皮下组织较为宽松，不利于移植脂肪的固定栽种，所以挑选小鼠的头部位置作为同种异体脂肪移植的预定位置，小鼠的头皮下部位可以较为牢固的将移植脂肪固定，有利于达到取材时间点时对移植的脂肪进行取材，首先将头部（移植部位）毛发剔除，以便于开放视野，有利于在预定位置进行移植，然后提起小鼠松弛的背颈部皮肤，使用25 m l注射器的针头从小鼠背颈刺入，沿皮下行至头皮部位后，按压针头所在的位置，防止移植脂肪组织流散，缓慢推压注射器，将注射器内的移植脂肪组织通过针头注射至小鼠的头皮下，每只小鼠的注射移植量为0.2 m l，对照组为0.2 m l纯脂肪组织，实验组为0.1 m l的脂肪组织加0.1 m l含有脂肪干细胞的透明质酸凝胶，总计0.2 m l。注射完成后迅速抽出针头，同时在退针部位按压10分钟，防止移植脂肪组织跟随针头出入轨迹溢出。等待至小鼠麻醉恢复后，放入笼舍，继续按照正常标准进行饲养，等待取材日期。

图1 成球ADSC的制备以及同种异体脂肪的手术示意图

1.6 移植脂肪取材检测

在同种异体脂肪手术3个月后将受体C57BL/6J小鼠处死，并取出头皮下的移植脂肪作为样本进行如下检测：（1）HE检测：将移植物组织块进行石蜡包埋，切片，利用碱性的苏木精染色将细胞核标记为蓝紫色，利用酸性的伊红染液将细胞质和细胞外基质标记为红色。（2）BODIPY颜色：使用BODIPY493/503染色特异性的标记脂滴,BODIPY染料是一种近红外的短波长荧光染料，特异性的作用于中性脂组成的脂滴，通过荧光显微镜的激发光在镜下呈现出带有绿色荧光的脂滴轮廓。（3）脂周蛋白免疫荧光染色：脂周蛋白是一类由富含固醇脂、甘油三酯的疏水性内核和由蛋白质、磷脂、胆固醇等组成的外壳构成的球状微粒，在脂肪细胞的正常代谢过程当中起重要作用，借此可以将脂周蛋白作为活性脂肪细胞的特异性标记，使其作为免疫荧光染色的特异性抗原被标记，而后使用荧光显微镜观察移植物当中脂周蛋白的表达情况，同时也代表着移植脂肪细胞的存活情况。

1.7 统计学方法

运用Prism 6软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，非正太分布资料采用Mann-WhitneyY检验，多组数据比较，采用单因素方差分析和LSD方法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

在手术完成结束后，有7只对照组小鼠的头皮下移植脂肪流散被消化吸收无法取材，有5只实验组小鼠的头皮下移植脂肪被消化吸收无法取材。将采取如下改进措施：在完成头皮下注射移植脂肪后，使用外科缝合的方式对移植部位（头皮下）进行缝合固定，防止移植脂肪与HA凝胶所组成的流体在皮下流散难以取材。

手术完成3个月后，分别将实验组和对照组的小鼠进行处死，取材。然后将取出移植脂肪进行HE染色，BODIPY染色以及脂周蛋白免疫荧光检测，见图2。

图2 有无ADSC参与的移植脂肪检测结果

荧光显微镜下观察脂周蛋白免疫荧光切片，每只小鼠进行3次于10×10镜下视野中计数成活脂肪细胞个数，统计结果，见图3。

图3 脂肪细胞计数结果统计

根据结果显示，有脂肪干细胞参与的同种异体脂肪移植实验的术后脂肪存活率高于没有脂肪干细胞参与的同种异体脂肪移植实验的术后脂肪存活率，说明脂肪干细胞对于同种异体脂肪移植排斥反应有一定的抑制作用。

3 讨论

现有研究结果已经表明自体脂肪移植手术的可行性，而在异体脂肪移植手术当中存在着各种免疫排斥反应，本

文已初步探索ADSC对于异体脂肪移植手术当中免疫排斥的抑制作用，或可通过这种抑制效果来提升术后移植脂肪的存活率［12-14］。然而对于异体脂肪移植后脂肪细胞的存活率提高具体可达到何种效果，还有待于进一步研究实验的进行。

在异体脂肪移植手术中以及移植术后的恢复阶段，会发生总计三种不同类型的免疫排斥反应，其发生的机制也各不相同，第一种类型是超急性免疫排斥反应，主要发生时间为移植物与宿主血管接通后的数分钟至24小时内，发生机制为在移植前已经产生供体同种异型抗原特异性抗体，在其他方面常见于反复输血，多次妊娠以及再次移植等情况，在本次研究当中可以忽略不计，第二种类型是急性免疫排斥反应，发生时间为移植后数天或数周，作为本次实验的主要排斥反应，其主要发生的是细胞免疫应答。急性免疫排斥反应还分为早期急性免疫排斥反正和中期急性免疫排斥反应，其中早期急性免疫排斥反应的主要发生机制为T细胞通过直接识别的方式活化，引发以CD8+CTL为主、CD4+TH1为辅的细胞免疫应答，中期急性免疫排斥反应的主要发生机制为T细胞通过间接识别的方式活化，以CD4+TH1细胞通过释放TH1型细胞因子介导产生的细胞免疫应答为主；以CD4+TH2细胞与B细胞协同作用介导产生的体液免疫应答为辅。第三种类型是慢性免疫排斥反应，发生时间为术后数月甚至数年，主要的病理特征为血管壁炎性细胞浸润、间质纤维化。引起慢性免疫排斥反应的主要因素有：（1）、T细胞和巨噬细胞等介导的迟发性超敏反应所产生的免疫损伤；（2）、B细胞产生的抗体活化补体或通过ADCC（抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用）破坏血管内皮细胞；（3）、急性免疫排斥反应反复发作所导致的移植物退行性性变。各种不用免疫排斥反应在不同时间段当中发生，以各种方式对移植物造成的损伤导致了异体脂肪移植术的移植脂肪成活率低下，而将宿主的脂肪干细胞与移植脂肪进行混合，将会对移植脂肪的成活率有所帮助［15-18］。

然而，脂肪干细胞究竟是通过什么方式改善了同种异体脂肪移植中移植物的成活状况［19］，究竟抑制了哪种免疫排斥反应类型当中的哪种发生机制以及脂肪干细胞在异体移植后的转归问题仍旧未可知也，这些问题还期待着进一步的深入探索。