分子标记辅助选择改良‘黄华占’的褐飞虱抗性与抗旱性

王飞名，孔德艳，刘国兰，刘 毅，余新桥,2，毕俊国，罗利军，张安宁*

(1上海市农业生物基因中心,上海201106；2上海市农业科学院庄行综合试验站,上海201415)

稻褐飞虱(Brown planthopper，BPH)是世界稻区主要水稻害虫之一，为单食性害虫，仅以水稻和普通野生稻为食及繁殖后代。褐飞虱是一种典型的刺吸式害虫，靠吸食水稻韧皮部汁液为生，为害较轻时导致水稻营养物质运输受阻，影响千粒重[1]；严重时造成水稻减产，甚至绝收[2]。目前，防控褐飞虱主要还是依赖于化学方法防治，不仅费时费工，而且对环境有害。生产实践表明，选育褐飞虱抗性水稻品种是控制褐飞虱危害的资源节约与环境友好的方法[3]。

分子标记辅助选择(MAS)能够快速而精确地选择目标基因，是一种导入有利基因进行遗传改良的有效方法[4]。Bph14和Bph15 是水稻中2个主效抗褐飞虱基因，分别定位于第3和第4染色体上,分别解释24%和16%的遗传变异[5]。李进波等[6]将来源于水稻品系B5 的抗性基因Bph15导入到‘93-11’等籼稻品种中，发现含有抗性基因的材料抗性较高，表明Bph15基因可以达到增强水稻褐飞虱抗性的目的。

我国稻田中65%以上为中低产田，其中干旱是最主要的产量限制因子之一。由于雨量在季节上分布不平衡,旱灾在长江流域、华南等稻区的发生较为频繁，一旦发生干旱，水稻将大幅减产。 培育和推广节水抗旱稻新品种,对于稳定和提高中低产田的产量水平具有重要意义。节水抗旱稻是指既具有水稻的高产优质特性、又具有旱稻的节水抗旱特性的一种新的水稻品种类型(农业行业标准NY/T 2862—2015)。在灌溉条件下，节水抗旱稻的产量、米质与普通水稻基本持平，但可节水50%以上；在望天田，其具有较好的抵抗干旱能力(或基本具有旱稻品种的抗旱能力)；在栽培上，简单易行，投入低，节能环保[7]。笔者所在团队通过水稻与旱稻资源的杂交，培育出了全球首例节水抗旱稻三系不育系沪旱1A[8]，并实现节水抗旱杂交稻三系配套；通过常规育种手段已培育出一批节水抗旱稻新品种并应用于生产，表现出明显的节水抗旱特性，目前已有‘沪旱15’‘旱优73’‘旱优113’和‘旱优3号’等多个品种通过审定，并且在安徽、湖北、广西等地大面积推广应用[9-11]。

作物抗旱性状比较复杂，涉及大量功能基因及其转录调控机制，单个基因的转移通常难以获得理想的效果。 常规育种往往利用抗旱性强的旱稻资源材料与高产优质的水稻品种杂交，在严格的水分胁迫条件下对分离世代的材料进行筛选，这种自然的选择压促使了抗旱相关基因的聚合[7]。

‘黄华占’是广东省农业科学院水稻所培育的优良常规稻品种，先后通过广东、湖北、湖南、海南、广西、浙江、重庆、陕西等省(市)审定。该品种生育期适中，抗倒性强，高产稳产，米质优[12]，适合直播，深受种植大户喜爱。以‘黄华占’为亲本，衍生了多个品种通过审定[13]。但笔者多年鉴定发现，其抗旱性与褐飞虱抗性较差。本研究拟以抗旱性好且携带褐飞虱抗性基因Bph15的节水抗旱稻材料M535(其系谱为：‘沪旱15’//沪旱1B/B5)为供体材料，以‘黄华占’为受体材料，通过杂交、回交和分子标记辅助选择，并进行严格的水分胁迫筛选，将Bph15基因与抗旱性导入到‘黄华占’背景中，旨在培育具有褐飞虱抗性与抗旱性的新品系。

1 材料与方法

1.1 抗性株系的选育方法

于2012—2016年进行选育，所有田间试验材料种植在上海市农业科学院庄行综合试验站以及海南陵水试验基地，分子标记检测在上海市农业生物基因中心实验室实施。以M535为供体亲本，以‘黄华占’为受体亲本，杂交后回交一次。对种植的30个BC1F1单株使用与Bph15连锁的分子标记Ms5进行目标基因检测，筛选出16株Bph15基因杂合单株，然后继续与‘黄华占’回交，得到BC2F1的种子，在30株BC2F1中取叶片进行分子标记筛选，检测出含有Bph15基因的杂合单株17株，选择与‘黄华占’田间农艺性状相似的6个单株。混收6个单株，种植2 000株于旱地进行抗旱性初筛，分子标记检测选择Bph15基因的纯合单株并进行表型鉴定选择，获得表型与‘黄华占’相似的12个单株。混收12个单株并种植200株BC2F3于旱地进行抗旱性复筛，此后再进行两轮抗旱性复筛，筛选出3株抗旱性明显提高，含有Bph15纯合基因，且表型与‘黄华占’相似的单株(BC2F5)，用于后续研究(图1)。

分子标记Ms5的引物正反序列分别为5’-TTGTGGGTCCCATCTCCTC-3’、5’-TGACAACTTGTGCAA-GATCAAA-3’[6]。采集水稻材料幼嫩叶片，用CTAB法快速提取DNA，PCR扩增体系参照楼巧君等[14]的方法。扩增产物在6%聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)上电泳，经银染法显带后检测。

1.2 遗传背景分析

2017年7月采集3个改良株系以及供体亲本M535、受体亲本‘黄华占’的叶片，委托华智水稻生物技术有限公司，利用56K水稻全基因组SNP芯片检测基因组差异，并计算遗传背景回复率[15]。

1.3 褐飞虱苗期鉴定方法

分别于2015年与2016年6—9月在江西省农业科学院农业应用微生物研究所进行褐飞虱抗性鉴定。采用国际标准苗期群体筛选法(SSST法)进行[16]，水稻浸种催芽后播种在鉴定圃水泥池内，每份材料设3个重复，每重复20株左右，播种4 d后定苗，每重复保留秧苗15株，在秧苗2—3叶期时按照每株褐飞虱2—3龄若虫5—7头的量进行接虫。苗期抗性评价参照IRRI[17]与陶林勇等[18]的方法进行。当感虫对照品种‘TN1’死苗率达到95%左右时按照表1标准进行调查。

表1 水稻苗期褐飞虱抗性分级标准

1.4 抗旱性及主要农艺性状考察

试验于2016年5—10月在上海市农业科学院庄行试验站的抗旱鉴定试验区进行；试验地前茬为大麦，土壤质地为壤土，土地较肥沃且地力均匀。

试验材料为3个改良株系以及轮回亲本‘黄华占’，抗旱对照品种为‘沪旱3号’。

参照中华人民共和国农业行业标准《NY/T 2863—2015节水抗旱稻抗旱性鉴定技术规范》进行抗旱性鉴定。将试验材料分别种植于抗旱鉴定岛(旱地)与抗旱鉴定岛旁边的水田，旱地与水田均采取直播方式种植，5月25日播种，穴播株行距为20cm×20cm，每穴点播3粒种子，小区大小为10穴/行×12行；6月10日间苗一次，密度为1株/穴。记载生育期，成熟期时两种处理各取第3行的第3、4、5穴进行考种，水田考察株高、穗长、有效穗数、每穗总粒数、结实率、千粒重、单株重，旱地考察单株重，计算抗旱指数。各小区实收并折算成标准含水量下的单产。

数据录入与统计分析分别利用Excel 2007及SPSS 19.0软件进行。

2 结果与分析

2.1 MAS与抗旱性筛选及目标株系的获得

2012年在上海配制F1杂交种，以后每年分别在海南与上海进行回交与自交。图2A为2014年在上海用分子标记Ms5筛选BC2F2代群体单株分子检测的部分结果，可以看出：分子标记Ms5在两个亲本P1与P2间表现出良好的多态性，杂合单株同时含有父本(M535)、母本(‘黄华占’)双亲的双条带，阳性纯合单株只有与M535相同的单条带，阴性纯合单株只有与‘黄华占’相同的单条带。通过分子标记辅助选择和田间农艺性状观察，获得了导入纯合Bph15基因且田间农艺性状与受体‘黄华占’相似的3个单株，编号分别为W1、W2、W3。2015年在上海种植BC2F4代株系并进行分子标记检测，每个株系检测13株。从图2B可知，所有的单株与供体亲本M535的带型相同，表明获得的目标株系均导入了纯合的Bph15基因。

2.2 改良株系的遗传背景分析

利用56K水稻全基因组SNP 芯片分析了3个改良株系的遗传背景。从56 000个SNP中挑选33 782个SNP分析受体亲本‘黄华占’与供体亲本M535的基因型差异，结果表明：两个亲本有差异的SNP总数为13 543个。3个改良株系W1、W2、W3的背景回复率分别为92.01%、88.18%和84.26%(图3)。

2.3 改良株系的苗期褐飞虱抗性鉴定

2015—2016年在江西省农业科学院农业应用微生物研究所，以受体亲本‘黄华占’、供体亲本M535、感虫品种‘TN1’为对照，对3个株系W1、W2、W3进行褐飞虱抗性鉴定。鉴定结果表明，对照品种‘TN1’两年中均表现高感，而供体亲本M535在两年均表现抗虫(表2)。3个株系W1、W2和W3也表现抗褐飞虱(3级)。受体亲本‘黄华占’两年的抗性级别分别为高感(2015年)与感虫(2016年)。

表2 目标改良株系对褐飞虱苗期抗性鉴定结果

注：数据为平均值±标准差，下同

2.4 改良株系的产量、主要农艺性状及抗旱性表现

在正常水分栽培管理下，3个改良株系的生育期与‘黄华占’一致，均为125 d。实测产量及8个主要农艺性状的比较分析结果(表3)表明，3个株系的产量、每穗总粒数、每穗实粒数、有效穗数、结实率等与‘黄华占’均没有显著差异。株系W2的穗长比‘黄华占’显著增长，其他2个株系的穗长与‘黄华占’无显著差异。株系W3的千粒重比‘黄华占’重，达到极显著水平，其他2个株系与‘黄华占’无显著差异。3个株系的株高均与‘黄华占’有极显著差异，且3个株系之间也有显著差异。

表3 目标改良株系与‘黄华占’的主要农艺性状比较

注：不同大小写字母分别表示同列数据在0.01或0.05水平上差异显著

抗旱鉴定结果(表4)表明，3个株系的旱地单株产量均比‘黄华占’高。3个株系的抗旱性级别均达到3级以上，其中W1、W3抗旱性级别达到2级，而‘黄华占’的抗旱性级别为4级。

表4 目标改良株系与‘黄华占’的抗旱性比较

3 结论与讨论

本研究结合分子标记辅助选择和常规育种方法，将褐飞虱抗性基因Bph15导入到优良常规稻‘黄华占’中，并通过抗旱性筛选与鉴定，获得3个既抗褐飞虱又抗旱且农艺性状优良的品系，为节水抗旱稻育种提供了重要的中间材料。基于MAS方法改良水稻抗病、抗虫性状已有一些成功的例子，但分子标记辅助选择在提高水稻的抗旱性上，特别是褐飞虱抗性与抗旱性聚合后的基因效应及其在水稻育种上的应用鲜有报道。

传统的水稻抗褐飞虱育种，主要是利用抗褐飞虱品种与改良亲本进行杂交，在分离世代进行多次褐飞虱抗性筛选，以期选育抗褐飞虱品种。但是褐飞虱鉴定需要人工养殖足够的虫源，费时费力，并且鉴定的结果受环境的影响较大，可能会入选抗性不好的假阳性单株。分子标记辅助育种技术不受这些限制，利用分子标记在低世代中鉴定导入纯合褐飞虱抗性基因的单株，提高了育种效率和准确性。本研究通过1次杂交和2次回交，结合分子标记辅助选择和田间表型筛选，选育出抗性与供体亲本一致的3个株系，仅用4年时间，明显提高了改良的效率。利用水稻育种芯片分析了3个改良株系的遗传背景，3个改良株系的背景回复率均高于80%，说明连续表型鉴定对于选择高背景回复率具有明显的效果。本研究选育出的3个株系，其褐飞虱抗性水平与供体M535一致，且鉴定结果连续两年稳定一致，可以确定W1、W2、W3可作为优良的褐飞虱抗性资源。但是，本研究选育的3个株系其褐飞虱抗性均未达到高抗及以上的程度，这可能是因为只导入了1个抗性基因Bph15。李进波等[3]研究发现，导入2个抗性基因的材料比含有单个抗性基因以及没有抗性基因的材料抗性高，表明基因聚合可以达到增强水稻褐飞虱抗性的目的。接下来的研究将在选育的株系中继续导入其他褐飞虱抗性基因，进一步提高其抗性水平。

本研究所用的供体亲本M535，其系谱来源为‘沪旱15’//沪旱1B/B5，其遗传组成上除了褐飞虱抗性材料B5，还有节水抗旱稻品种(系)‘沪旱15’与沪旱1B。本研究通过杂交技术，将‘沪旱15’与沪旱1B的抗旱相关基因导入轮回亲本中，通过4轮严格的水分胁迫筛选，促使了抗旱相关基因的聚合并进行抗旱性表达[7]，取得显著的效果。本研究选育的3个株系，其抗旱性明显优于轮回亲本‘黄华占’，W1、W3的抗旱级别甚至达到2级，与抗旱对照品种‘沪旱3号’抗旱性一致，可以认为W1、W2、W3可作为优良的抗旱性资源。

本研究表明，3个改良株系与‘黄华占’在产量、生育期上基本一致，除了株高增高外，其他主要农艺性状也基本一致。因此，可以认为3个株系W1、W2、W3可以作为‘黄华占’的抗旱性、褐飞虱抗性改良系。但本试验没有涉及到3个改良株系的稻米品质表现以及生态适应性表现，尚需进一步研究。