复合发酵剂对羊肉香肠发酵成熟过程中理化品质及安全性能的影响

王德宝 孙学颖 王柏辉 田建军 靳 烨* 吕金积 赵丽华

（1 内蒙古农业大学食品科学与工程学院 呼和浩特010018 2 内蒙古草原晶鑫食品有限公司 内蒙古巴彦淖尔015000）

发酵香肠因其诱人的玫瑰色泽、 独特的风味而深受消费者的青睐， 然而发酵成熟过程中理化品质的变化带来的食品安全问题引起世界范围的广泛关注。 发酵香肠是指在自然或人工控制条件下，将切碎瘦肉与丁状脂肪及发酵剂、亚硝酸钠等辅料混匀腌制后灌入肠衣， 经微生物发酵剂发酵及干燥成熟等制成一类肉制品[1-2]。 亚硝酸钠是腌制肉制品中的关键辅料， 与肌红蛋白结合形成亚硝基肌红蛋白，可赋予香肠诱人玫瑰色泽，并可抑制肉毒梭状芽孢杆菌生长及不饱和脂质过度氧化，也利于产品良好风味形成[3-4]。 然而，酸性条件下亚硝酸钠易转化为亚硝化试剂——亚硝酐（N2O3）[5-6]，其可与香肠中蛋白分解产生的肿胺、生物胺形成毒性极强， 可诱发癌症的物质N-亚硝胺， 如二甲基亚硝胺 （NDMA）和二乙胺亚硝基（NDEA）等。 1987年国际癌症研究机构（IARC）将NDMA 和NDEA 列为2A 级致癌物， 其它亚硝胺被列为2B 级（可能致癌物）[7]。

目前，亚硝胺被发现广泛存在于各类食物中，成为公认对健康存在危害的致癌物。 抑制食品中亚硝胺数量的有效途径是降低腌制肉制品中其前体物质亚硝酸盐残留量。 多年来研究主要集中于寻找食品中亚硝酸盐替代物和降低食品中亚硝酸盐残留有效途径等方面。 虽然不少学者致力于研究亚硝酸盐替代物， 但是其不能完全替代亚硝酸盐的发色、抑菌、抗氧化和增强风味等多重作用。近年来利用微生物发酵剂降低肉制品中亚硝酸盐残留和亚硝胺数量成为研究热点。陈希等[8]从侗族发酵肉中分离得到一株乳酸菌， 将其应用到干发酵香肠时， 发酵剂组亚硝酸盐含量在成熟过程中迅速降低。Paik 等[9]从韩国泡菜中分离得到具有较强耐亚硝酸盐特性的短乳杆菌KGR3111 和植物乳杆菌（KGR 5105），在模拟发酵香肠条件下120 h 内可降低亚硝酸盐总量14.84%～18.06%。 孙芳达等[10]通过在哈尔滨干肠中添加清酒乳杆菌、戊糖及弯曲乳杆菌， 成熟结束时发酵剂组亚硝酸盐和亚硝胺含量显著低于对照组。 本试验中通过添加清酒乳杆菌、 木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌制作发酵香肠， 探究不同发酵剂对发酵羊肉香肠理化品质及安全性能的影响， 以此为实际生产应用提供理论依据及数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

原料肉：羊肉（肥瘦质量比为1∶4），源自内蒙古巴彦淖尔乌拉特苏尼特羊后腿及羊尾。 肠衣：25～30 mm 羊小肠。

发酵剂：清酒乳杆菌（Lactobacillus sake）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）及肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus），由内蒙古农业大学肉品微生物实验室提供。

主要药品：色胺（Tryptamine，TRY）、苯乙胺（Phenylethylamine，PHE）、腐 胺（Putrescine，PUT）、色胺（Cadaverine，CAD）、组胺（Histamine，HIS）、酪胺（Tyramine，TYR）、精胺（Spermine，SPM）及亚精胺（Spermidine，SPD）8 种生物胺标品与单磺酰氯，色谱级， 购于美国Sigma 公司；N-亚硝胺混标（2 000 μg/mL）：N-二甲基亚硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）、N-二乙基亚硝胺 （N-nitrosodiethylamine，NDEA）、N-甲基乙基亚硝胺（N-nitrosomethylethylamine，NMEA）、N-二丁基亚硝胺（Nnitrosodibutylamide，NDBA）、N-二丙基亚硝胺（Nnitrosodipropylamine，NDPA）、N-亚硝基哌啶 （Nnitrosopiperidine，NPIP）、N-亚硝基吡咯烷 （N-nitrosopyrrolidine，NPYR）、N-亚硝基吗啉 （N-nitrosomorpholine，NMOR）、N-亚硝基二苯胺 （N-nitrosodiphenylamine，NDpheA）， 色谱级， 购于美国Sigma 公司；甲醇、乙腈，色谱级，购于美国Thermo公司。

1.2 仪器与设备

主要仪器：Agilent1260 高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；TG16-WS 台式高速离心机， 湖南离心机仪器有限公司；GC2014 岛津气相色谱仪，日本岛津公司；LRH-250-HS 型恒温恒湿培养箱，沈阳亮衡天平仪器有限公司；HH-6 数显式恒温水浴锅， 国华电器有限公司；RE-52AA 旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；TU-1800 紫外分光光度计，日本HMADZU 公司；HD-3A 智能水分活度测量仪， 深圳市银都科技有限公司；TCP2 全自动测色色差计，北京奥依克光电仪器。

1.3 工艺及其配方

参照赵丽华等[11]方法并稍作修改。

配方：羊后腿肉80%、羊尾肥膘20%、蔗糖0.5%、食盐2.5%、亚硝酸钠70 mg/kg、葡萄糖0.5%、硝酸钠150 mg/kg、抗坏血酸钠0.05%、发酵剂107CFU/g。

表1 发酵羊肉香肠加工工艺条件Table 1 Fermented mutton sausage processing conditions

1.4 试验设计

试验设计共分为4 组，各组香肠配方一致，所加发酵剂不同：第1 组为对照组（CO），无添加外源发酵剂；第2 组为单一清酒乳杆菌（L. sakei，简称LB）； 第3 组为清酒乳杆菌和木糖葡萄球菌复合发酵剂（L. sakei+S. xylosus，简称LS）；第4 组为清酒乳杆菌、 木糖葡萄球菌及肉葡萄球菌复合发酵剂 （L.sakei +S.xylosus + S. carnosus， 简称LSS）。样品分别于灌肠后（0 d）、发酵结束（1 d）、干燥（3 d）、成熟（3 d）等4 个工艺点各随机抽取，并测定色泽、水分活度（Aw）、酸度（pH）、硝酸盐、亚硝酸盐、生物胺及亚硝胺，分析不同发酵剂对降低香肠中亚硝酸盐、生物胺、亚硝胺等食品安全指标的影响。

1.5 试验方法

参照GB/T 9695.5-2008 《肉与肉制品pH 测定》、GB 5009.33-2010《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》、GB 5009.208-2016 《食品安全国家标准食品中生物胺的测定》、GB 5009.26-2016《食品安全国家标准 食品中N-亚硝胺类化合物的测定》测定香肠pH、硝酸盐、亚硝酸盐、生物胺及N-亚硝胺含量[12-15]；使用HD-3A 型智能水分活度仪及TCP2 全自动色差计测定香肠品质指标水分活度（Aw）与红度（a*）。

1.6 数据处理

采用Microsoft Excel 和Spss19.0 对数据进行统计处理和显著性分析，P<0.05 表示差异显著；并通过Sigmaplot 12.5 作图。

2 结果与分析

2.1 不同发酵剂对发酵羊肉香肠pH 值的影响

不同发酵剂对发酵羊肉香肠pH 值影响如图1。 由图1 可知，添加发酵剂组香肠pH 值在发酵成熟过程呈先下降后上升的趋势。 0～1 d 发酵过程，对照组（CO）、单一清酒乳杆菌组（LB，L. sakei）、清酒乳杆菌和木糖葡萄球菌复合发酵剂组（L.sakei+S. xylosus，LS）及清酒乳杆菌、木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌复合发酵组（L. sakei+S. xylosus+ S. carnosus，LSS）4 组发酵羊肉香肠pH 值急剧降低，由起始约5.50 分别降低至4.83，4.61，4.57，4.45，发酵结束添加发酵剂组pH 值显著低于对照组（P<0.05），Lorenzo、Wang、Nie 等[16-18]研究结果表明发酵期间乳酸菌等发酵剂数量快速增加促使肉中碳水化合物分解为乳酸等小分子有机酸， 乳酸等有机酸积累致使发酵剂组pH 值下降速率显著快于对照组。 发酵结束后干燥初期（1～4 d），发酵剂组pH 值仍有小幅下降；而在4～7 d 成熟期间，发酵剂组pH 值呈现不同程度上升， 这可能由于发酵剂分解蛋白质产生氨、 三甲胺等碱性物质的原因[19]。而低pH 值有利于改善香肠色泽、口感，改变蛋白质与水分结合能力和抑制香肠中肠杆菌等一类有害及致病菌生长繁殖。 成熟结束后4 组羊肉香肠pH 值均低于发酵香肠安全酸度要求5.3[20]。

图1 不同发酵剂对发酵羊肉香肠发酵成熟过程pH 值变化的影响Fig.1 Effect of different starter cultures on pH value of fermented mutton sausages in fermentation and ripening process

2.2 不同发酵剂对发酵羊肉香肠Aw 变化的影响

不同发酵剂对发酵羊肉香肠Aw 值变化的影响如图2。 4 组发酵羊肉香肠Aw 在发酵成熟整个过程下降显著，由起始0.96 分别降低到成熟结束时0.73，0.71，0.69 和0.67。 发酵结束（1 d）时各组Aw 值与0 d 时差异不显著（P<0.05），这可能是由于发酵期间香肠所处制作环境湿度 （RH：90%～95%）较高，不利于香肠内部水分向环境扩散。 随着pH 值和制作环境湿度降低， 改变了香肠中蛋白质与水分结合能力[21]，促使香肠Aw 在干燥成熟期间急剧下降，发酵剂组Aw 显著低于对照组（P<0.05）， 且L.sakei+S.xylosus+S.carnosus 组Aw在干燥成熟期间均最低，这说明Aw 下降与pH 变化具有一定线性关系， 这一结果与Hamoen、Sun等[22-23]研究结果相一致。 成熟结束，对照组Aw 显著高于发酵剂组（P<0.05）， 且发酵剂组Aw 表现为：L. sakei > L. sakei + S. xylosus > L. sakei + S.xylosus+S.carnosus 组，说明复合发酵剂更有助于降低香肠Aw 值。 低Aw、pH 值有利于抑制香肠中可产生致癌物亚硝胺的肠杆菌等有害菌及致病菌生长繁殖，从而可提高香肠品质和安全性，延长香肠货架期[23]。

2.3 不同发酵剂对发酵羊肉香肠红度（a）变化的影响

不同发酵剂对发酵羊肉香肠色泽红度值（a）变化的影响如图3。 由图3 可知，4 组发酵香肠红度值随着发酵成熟时间变化呈先上升后下降的趋势，且发酵剂组红度a 值显著高于对照组（P<0.05），说明香肠红度值受到制作时间和发酵剂联合影响，这一结果与José 等[24]作者研究相一致。 各组香肠红度值在发酵过程中逐渐增加， 并在结束时达到最高， 这一增加的原因明显是由于亚硝酸盐与肉中肌红蛋白结合形成了有助于改善香肠红度的亚硝基肌红蛋白， 香肠迅速酸化和抗环血酸钠的添加对红度改善可能也起到一定作用[25-27]；并且CO 红度值

图2 不同发酵剂对发酵羊肉香肠发酵成熟过程Aw 变化的影响Fig.2 Effect of different starter cultures on water activity of fermented mutton sausages in fermentation and ripening process

图3 不同发酵剂对发酵羊肉香肠发酵成熟过程色泽红度（a）变化的影响Fig.3 Effect of different starter cultures on red color of fermented mutton sausages in fermentation and ripening process

2.4 不同发酵剂对发酵羊肉香肠中硝酸盐及亚硝酸盐变化的影响

硝酸盐和亚硝酸盐常被作为辅料添加于腌制肉制品中， 亚硝酸盐拥有利于肉制品发色和风味物质形成、抑制有害菌活性和不饱和脂质氧化，并且还可减弱不利风味物质产生等特点[29]。 不同发酵剂对发酵羊肉香肠硝酸盐及亚硝酸盐变化的影响如图4。 由图4 可知，4 组香肠中硝酸盐一直保持下降趋势，而亚硝酸盐呈先下降后上升的趋势。发酵期间亚硝酸盐含量急剧下降的结果可能由于亚硝酸盐与肉中肌红蛋白结合形成了有助于改善色泽红度的亚硝基肌红蛋白[25-27]，这一结果与香肠发酵期间红度值大幅上升相呼应； 也可能部分亚硝酸盐在酸性条件下与肿胺等结合形成亚硝胺或亚硝酰胺[5]，或被乳酸菌等发酵剂分解[30]。 发酵结束后各组亚硝酸盐含量逐渐增加， 可能由于香肠中存在硝酸盐还原菌及还原酶的原因， 促使香肠中硝酸盐大幅下降并被转化为亚硝酸盐[31]。由图4可知对照组硝酸盐含量下降幅度最大， 亚硝酸盐含量在成熟结束（7 d）（26.47 mg/kg）达到组中最高，显著高于发酵剂组（P<0.05）；而4 d 末与7 d末发酵剂组亚硝酸盐含量差异不显著 （P>0.05），成熟结束3 组添加发酵剂香肠含量分别为18.54，18.43，19.34 mg/kg，显著低于国家对香肠中亚硝酸盐残留量标准（30 mg/kg）[32]。 说明添加微生物发酵剂可能抑制硝酸盐向亚硝酸盐转变， 并可抑制具有诱导癌变作用的亚硝胺的前体物-亚硝酸盐在香肠中积累，提高了香肠食用品质和安全性。

2.5 不同发酵剂对发酵羊肉香肠中生物胺变化的影响

图4 不同发酵剂对发酵羊肉香肠发酵成熟过程硝酸盐及亚硝酸盐变化的影响Fig.4 Effect of different starter cultures on nitrate and nitrite residual of fermented mutton sausages in fermentation and ripening process

生物胺是游离氨基酸经脱羧酶脱羧后形成，若被大量摄入会对身体产生一定毒害作用[33]。其中腐胺和尸胺不仅对人体无益处， 而且在微生物和酶的作用下易与亚硝酸盐生成N-亚硝胺[34]。 由表2 可知， 不同发酵剂对发酵羊肉香肠中生物胺变化的影响下共被检出6 种， 总生物胺含量随着制作时间延长呈现显著上升趋势， 这主要由于香肠中色胺增加速率远高于其它胺（P<0.05）。 原料肉中色胺含量约为33.23～36.13 mg/kg， 不同阶段含量差异极显著（P<0.01），且发酵剂组色胺含量显著高于对照组（CO），表明微生物发酵剂对香肠中色氨酸具有一定脱羧作用。 相比香肠中其它生物胺类物质可知，CO 组尸胺含量虽低于色胺， 但显著高于苯乙胺和腐胺的含量， 而发酵剂组（L.sakei、L.sakei+S.xylosus 及L.sakei+S.xylosus+S.carnosus）均未检出尸胺，说明发酵剂对尸胺具有显著抑制作用， 这可能由于微生物发酵剂迅速成为优势菌且快速产酸作用致使香肠中肠杆菌生长被抑制[35]；且CO 和L. sake 两组腐胺被检出（1 d 末）早于L.sakei+S.xylosus 及L.sakei+S.xylosus+ S.carnosus 组（4 d 末），成熟结束时CO 组腐胺含量显著高于发酵剂组（P<0.05），且L.sakei+S.xylosus 及L.sakei+S.xylosus+S.carnosus 两组含量低于L.sakei 组，说明复合发酵剂对腐胺抑制作用更加明显。 而尸胺和腐胺常被作为衡量食品卫生的一个重要指标[36]，因而抑制尸胺和腐胺的含量可显著提高香肠食用品质和安全性。 CO、LB、LS 3 组苯乙胺呈逐渐上升趋势， 而L.sake+S.xylosus+S.carnosus 组仅在4 d 末检出，含量仅为7.59 mg/kg。 组胺是生物胺中毒性最强胺类，酪胺次之，像腐胺、尸胺、酪胺存在可提高组胺毒性效应[37]。由表2 可知，组胺仅在CO 和L. sake 干燥结束时（4 d 末）检出，且含量分别为1.02 和0.23 mg/kg，远低于美国食药局毒性限量指导标准（50～100 mg/kg）。 酪胺仅在CO、L. sakei 及L. sakei +S. xylosus 3 组发酵结束时检出， 而L. sakei+ S.xylosus+S.carnosus 组仅在4 d 末检出，其它阶段酪胺仍有一定峰值， 但其含量低于检出限。 总体上， 添加复合发酵剂有助于抑制香肠中肠杆菌等腐败菌生长繁殖，限制有害生物胺的形成。

2.6 不同发酵剂对发酵羊肉香肠中亚硝胺变化的影响

亚硝胺危害性成为世界公认的食品安全问题， 其前体物质亚硝酸盐在酸性条件下可能生成亚硝化试剂-亚硝酐，此时亚硝酐将与肿胺等物质直接生成亚硝胺[5-6，38]。 由表3 可知，香肠制作过程中共检出3 种亚硝胺，分别为NMEA、NPYR、NDBA，4 组香肠并未检出毒性较强的NDMA 和NDEA。从检查结果可知，原料肉中并无亚硝胺，且在香肠发酵结束时仅在对照组检出唯一亚硝胺-NDBA（3.10 μg/kg），在干燥过程中NMEA、NPYR、NDBA 均出现在对照组中，而发酵剂组无一检出。香肠成熟结束时，对照组中NDBA 未被检出，而检出的NMEA 含量显著高于L. sakei、L. sakei + S.xylosus 和L.sakei+S.xylosus+S. carnosus 3 组，且对照组中还检出NPYR（8.64 μg/kg）。 根据亚硝胺检出情况， 可知添加乳酸菌甚至是复合发酵剂更有利抑制亚硝胺的形成， 这一结果与孙芳达[10]的研究相一致。

表2 不同发酵剂对发酵羊肉香肠发酵成熟过程生物胺变化的影响Table 2 Effect of different starter cultures on biogenic amines of fermented mutton sausages in fermentation and ripening process

表3 不同发 酵剂对发酵 羊肉香肠发 酵成熟过程N-亚硝胺 变化的影响Table 3 Effect of different starter cultures on N-nitrosamines of fermented mutton sausages in fermentation and ripening process

3 结论

通过添加复合发酵剂（L.sake+S.xylosus+S.carnosus，LSS）可促使香肠pH 和Aw 快速下降，且下降速率快于CO、LB 和LS 3 组； 并且能够提高香肠红度值，抑制亚硝酸盐在香肠中残留；能够有效抑制组胺和酪胺、 亚硝胺等有害胺类物质在香肠中积累。从而，添加复合发酵剂可缩短发酵羊肉香肠制作周期、延长其货架期、提高香肠产品安全性。