膳食补充芝麻素对APP/PS1转基因小鼠认知障碍的改善作用及机制

马少博 李 铃 刘志刚 刘学波

（西北农林科技大学食品科学与工程学院 陕西杨凌712100）

随着社会经济的发展和医疗健康领域的进步，我国社会人口结构老龄化趋势愈加明显。目前我国超过65 周岁的老龄化人群已达到总人数的11.4%， 并且预计在2035年达到总人数的20%左右，促使中国进入深度老龄化阶段[1]。 随着这一社会问题的加剧，衰老相关的神经退行性疾病，如阿尔兹海默症、帕金森症等脑健康问题日益凸显。阿尔茨海默症（Alzheimer’s Disease，AD）又称为老年痴呆症，是一种与衰老相关的精神退行性疾病，其特征是记忆力逐渐减退并伴随着认知障碍[2-3]。目前它的发病机制尚未明确， 而AD 往往伴随着Aβ 的沉积、神经炎症的发生和Tau 蛋白的过度磷酸化[4]。 Tau 蛋白的过度磷酸化已被证明与胰岛素信号的抑制相关[5]。 近年来，通过调整膳食结构干预并改善脑健康已经成为食品营养学的研究热点。 已有大量研究从植物中分离出多种具有潜在神经保护作用的多酚、类胡萝卜素、木脂素类活性成分[6-9]。

芝麻素是我国特色油料作物芝麻中的一种主要的木脂素类活性物质， 在芝麻籽中质量分数为0.1%～0.5%[10]，分子式为C20H18O6，其化学结构见图1a 所示。 研究表明，芝麻素具有抗氧化、抗衰老、抗炎、 减少动脉粥样硬化和抗高血压等生理功能[11-14]，可作为膳食减脂补充剂。有研究[6-7]证明，膳食补充芝麻素可抑制慢性压力模型小鼠中脑部神经炎症， 增加突触可塑性并改善小鼠认知及情绪障碍，还可以防止慢性压力引起的神经元损害。此外，芝麻素可以抑制由6-羟基多巴胺毒性引起的星形胶质细胞异常激活[15]。 然而，目前鲜有文献报道芝麻素能够改善与衰老相关的脑健康问题。

本研究选用APP/PS1 转基因（AD 模型）小鼠作为认知障碍动物模型， 通过饮食补充芝麻素3个月， 采用行为学测试评估芝麻素干预对小鼠认知功能障碍的改善作用。通过免疫组化、免疫印迹试验（Western blot）等方法探究补充芝麻素对小鼠脑部神经炎症及神经损伤的改善作用及机制，为通过食源性补充芝麻素的方式预防和改善衰老导致的认知障碍、 神经炎症等脑健康问题提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芝麻素（98%，S25758），源叶生物技术有限公司（中国上海）；TRIzol 试剂，金彩生物技术有限公司；RNA 提取试剂盒、 反转录试剂盒和SYBR PCR 试剂盒， 大连TaKaRa 公司；IBA-1 和PSD-95 一抗，美国Cell Signaling Technology 公司；山羊抗兔IgG 荧光二抗（goat anti-rabbit，4413）及山羊抗鼠 IgG （H+L）荧光二抗 （goat anti-mice，4408），美国Cell Signaling 公司；抗荧光衰减封片剂（S2110），北京索莱宝公司；细胞裂解缓冲液，中国江苏博伊泰生物技术研究所； 组织蛋白提取试剂及BCA 蛋白试剂盒， 中国上海Thermo Fisher公司；中性树胶以及苏木精-伊红，南昌雨露实验器材有限公司。

1.2 仪器与设备

莫里斯水迷宫（XR-XM101），上海欣软信息科技有限公司；倒置荧光显微镜，日本Olympus 公司；电泳装置（PowerPac 220V），美国伯乐公司；化学发光凝胶成像系统（ChemiDocTMXRS），美国伯乐公司；台式高速冷冻离心机（5417R），德国Eppendorf 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 动物实验分组 6月龄的雌性B6C3-Tg（APPswe，PSEN1dE9）85Dbo 转基因小鼠， 由南京大学模式动物研究中心提供。小鼠具体分组（n：5～7）及饲喂方式见表1。 标准饲料（AIN93M）及含有芝麻素的饲料均由南通特洛菲饲料科技有限公司提供。 用不同饲料干预小鼠3 个月后进行行为学试验，在此期间每4 d 记录1 次体重，每天记录食物和水的摄入量。行为学试验后通过腹腔注射4%水合氯醛麻醉小鼠，眼眶取血后脱颈处死小鼠，解剖后取出脑组织保存在-80 ℃，后续再进行生化分析。 具体试验操作参照图1b。 所有试验程序遵循动物伦理委员会试验动物护理和使用指南 （第8版），ISBN-10：0-309-15396-4。 该动物试验方案已获得西北农林科技大学动物伦理委员会的批准。

表1 实验小鼠分组及饲料剂量Table 1 Group of experimental mice and dosage of diets

图1 芝麻素的化学结构以及试验操作的时间轴Fig.1 Chemical structure of sesamin and scheme for experiments

1.3.2 行为学试验 采用莫里斯水迷宫探究小鼠认知记忆功能， 具体试验方法根据参考文献[16]。本试验主要利用小鼠厌水特性， 分别对小鼠进行适应性训练、 定位巡航、 空间探索3 个步骤的试验。水迷宫为直径1 m，高35 cm 的圆形水台，其内部安置1 个圆形小水台供小鼠寻找。 在开始试验前， 水迷宫被分为4 个象限并在水池壁上放上不同标识，作为动物的认知参考。试验期间利用视频记录设备记录小鼠游动时间、距离与轨迹。在适应性训练后小鼠休息1 d 并进行定位巡航试验，记录小鼠在第1，3，5，7 天找到迷宫中小平台所用时间， 以及第8 天空间探索试验中小鼠在目标象限的游泳路程，计算在目标象限路程占比：

1.3.3 样本收集及指标测定

1.3.3.1 组织形态学观察 将脑组织包埋在石蜡中，用切片机切成6 μm 的组织薄片，使用苏木精和曙红（H&E）染色并通过免疫组织化学、免疫荧光的方法将切片与不同抗体孵育，封片后，分别使用普通光学显微镜、 荧光显微镜观察海马的CA1区域， 具体观察组织形态、 突触后致密蛋白-95（post-synaptic density protein 95，PSD-95）、小胶质细胞激活状态下的标志物 （ionized calcium binding adaptor molecule 1，IBA-1）及Aβ 的沉积。 具体方法见文献[17]。

1.3.3.2 mRNA 水平相对含量测定 按照RNA提取试剂盒（MiniBEST Universal RNA Extraction Kit）说明书的方法在冷冻组织中提取RNA，测定RNA 含量后， 使用反转录试剂盒将RNA 反转录为cDNA， 按照SYBR PCR 试剂盒说明书添加SYBR 荧光染料及特定引物形成反应体系 （引物序列见表2），用PCR 仪扩增，2-△△Ct方法分析基因PSD-95、 白细胞介素-1 （interleukin 1 beta，IL-1β）、 胰岛素降解酶 （insulin-degrading enzyme，IDE）以及IBA-1 在mRNA 水平的相对表达量。

表2 实时定量PCR 所用引物序列Table 2 Primer sequences used for semi-quantitative RT-PCR analysis

1.3.3.3 蛋白水平相对含量测定 将大脑皮层组织在低温匀浆， 按照组织蛋白提取试剂盒说明书提取组织中蛋白。使用BCA 蛋白质试剂盒确定组织中总蛋白质浓度。 将蛋白溶解在SDS 样品缓冲液中， 然后立即在95 ℃加热10 min。 通过SDSPAGE 分离蛋白质，并将其转移到PVDF 膜上。 孵育对应抗体后，用化学发光试剂观察免疫反应带，并通过蛋白质印迹来测定AD 相关基因在蛋白水平的相对表达量。

1.3.4 统计学分析 试验数据均以“平均值±标准误”表示，使用Graphpad Prism 6.0 软件的Newman-Keuls 检验进行数据统计分析。 由于试验为双因素， 因此显著性分析选择two-way ANOVA。P<0.05 为差异具有显著性，P<0.01 为差异具有极显著性。 若P<0.05，则均值被认为具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 芝麻素对APP/PS1 转基因小鼠体重、 饮水及摄食的影响

由图2a 可知，4 组小鼠的体重在饲养的9 周内均无显著性差异（P>0.05）。 为了探究体重与摄食量之间的关系， 每天记录小鼠摄食， 结果如图2c 所示，4 组的摄食量没有出现显著性差异 （P>0.05），这说明芝麻素对野生型小鼠及APP/PS1 转基因小鼠的体重无显著影响。 由图2b 可知，饲喂含有芝麻素饲料的野生型小鼠 （WT+SE 组）和APP/PS1 转基因小鼠（AD+SE 组）的饮水量显著低于饲喂标准饲料的野生型小鼠（WT 组）和APP/PS1 转基因小鼠（AD 组）（P<0.01）。

图2 芝麻素对APP/PS1 转基因小鼠体重、饮水量及摄食量的影响Fig.2 Effects of sesamin treatment on the body weight， water intake and food intake in APP/PS1 transgenic mice

2.2 芝麻素对APP/PS1 转基因小鼠认知障碍的影响

利用水迷宫对APP/PS1 转基因小鼠的认知能力进行测试。 如图3a 所示，在第7 天定位巡航试验的轨迹图中，AD 组小鼠寻找平台的轨迹距离为最长，而AD+SE 组轨迹距离明显缩短。 在定位巡航实验中，如图3b 所示，不同组的逃避潜伏期存在差异。 在第7 天的测试中，与WT 组小鼠相比，AD 组的小鼠寻找平台所需时间显著增加 （P<0.05）。同时，与AD 组相比，AD+SE 组小鼠的逃避潜伏期显著减少（P<0.05）。 以上结果表明补充芝麻素能够改善APP/PS1 转基因小鼠认知障碍。

图3 芝麻素对APP/PS1 转基因小鼠认知障碍的影响Fig.3 Effects of sesamin treatment on the cognitive disorder in APP/PS1 transgenic mice

在空间探索试验中， 主要记录小鼠在目标象限中的路程占比， 路程占比越高小鼠认知能力越强。 如图3c 所示，与WT 组小鼠相比，虽然WT+SE 组的小鼠在目标象限中的路程占比更高，但是无显著性（P>0.05）。同样地，与AD 组相比，AD+SE组小鼠在目标象限中的路程占比增加。 这一结果说明补充芝麻素能够提升APP/PS1 转基因小鼠的认知能力。 综上，补充芝麻素能够显著改善AD 引起的认知障碍。

2.3 芝麻素对APP/PS1 转基因小鼠海马中神经元损伤和突触功能障碍的预防作用

2.3.1 芝麻素对APP/PS1 转基因小鼠海马区域神经元损伤的影响 采用苏木精和伊红染色 （H &E）的方法观察小鼠海马神经元细胞的形态结构与分布情况，由图4a 所示，与WT 组相比，AD 组小鼠的海马CA1 区神经元排列明显断裂，且有神经元丢失甚至核固缩的现象。 而膳食补充芝麻素后能改善阿尔兹海默症造成的神经细胞形态结构的异常，减少神经元的碎片化及凋亡。 由此可见，芝麻素可抑制由阿尔兹海默症造成的神经元损伤。

2.3.2 芝麻素对APP/PS1 转基因小鼠突触功能障碍的影响 采用免疫荧光观察小鼠海马PSD-95蛋白水平的表达与分布情况， 并通过RT-PCR 和Western-blot 测定小鼠皮层中PSD-95 基因在mRNA 和蛋白水平相对表达量。 由图4a、4b 所示，补充芝麻素， 显著增加了APP/PS1 转基因小鼠海马CA1 区及皮层中PSD-95 mRNA 表达 （P<0.05）。 图4c 所示，4 组小鼠皮层中的PSD-95 蛋白表达之间没有显著性差异（P>0.05）。 综上所述，芝麻素能改善由阿尔兹海默症造成的突触功能障碍。

图4 芝麻素对APP/PS1 转基因小鼠海马病理学变化和PSD-95 水平的影响Fig.4 Effects of sesamin on histopathological changes and the PSD-95 levels in the cortex of APP/PS1 transgenic mice

2.4 芝麻素对APP/PS1 转基因小鼠脑内Aβ 积累的影响

采用硫磺素S 染色和免疫荧光观察小鼠海马CA1 区Aβ 和Aβ1-42 的积累与分布情况，结果如图4a 所示。 对荧光染色图中Aβ 的荧光强度进行定量分析，如图4b 和4c 所示，AD 组与AD+SE 组的Aβ 积累有显著差异（P<0.01），表明芝麻素能显著降低APP/PS1 转基因小鼠海马CA1 区Aβ 的积累。 通过RT-PCR 探究小鼠皮层中基因APP 在mRNA 水平的表达情况。由图4d 所示，AD 组小鼠皮层中的APP 在mRNA 水平相对含量显著高于WT 组小鼠（P<0.01），而膳食补充芝麻素后小鼠皮层中APP 在mRNA 水平的相对含量显著降低（P<0.05）。综上所述，芝麻素可抑制小鼠脑内Aβ 的积累。

图5 芝麻素对APP/PS1 转基因小鼠脑内Aβ 和Aβ1-42 水平的影响Fig.5 Effects of Sesamin on Aβ and Aβ1-42 levels in the brain of APP/PS1 transgenic mice

2.5 芝麻素对APP/PS1 转基因小鼠脑内神经炎症的影响

据报道，神经炎症是AD 潜在的风险因素。 由图6a 和图6b 所示， 采用免疫组化观察小鼠海马中IBA-1 的表达与分布情况并进行定量分析，结果显示， 对AD 模型小鼠补充芝麻素能够显著减少IBA-1 在免疫组化中阳性细胞数目（P<0.05）。通过RT-PCR 探究小鼠脑皮层中炎症相关基因表达情况， 结果如图6c 和图6d 所示， 与WT 组相比，AD 对照组小鼠皮层中的炎症相关基因IL-1β（P<0.01）和IBA-1（P<0.05）mRNA 相对含量显著增高，而膳食补充芝麻素显著抑制了IL-1β 和IBA-1 的表达（P<0.01）。 综上，补充芝麻素能够显著降低APP/PS1 转基因小鼠脑内神经炎症。

2.6 芝麻素对APP/PS1 转基因小鼠脑部AKTPI3K 信号通路的调节作用

IDE 在脑部通过水解Aβ，减少Aβ 的积累，从而减少阿尔兹海默症对大脑的影响。 胰岛素通路AKT-PI3K 已被证明与AD 的可能病因相关[5]。 通过Western blot 试验对以上假设进行探究。 图7a为Western blot 代表性图像。 如图7b、7c 和7d 所示，补充芝麻素使淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）、 蛋白激酶B （protein kinase B，AKT）、IDE 蛋白相对表达量显著提升（P<0.05）。同样，如图7e 所示，基因IDE 在mRNA 的相对含量得到提升（P<0.01）。 综上所述，芝麻素激活了AKT-PI3K 信号通路， 且提高了IDE 在mRNA 水平及蛋白的相对表达。

图6 芝麻素对APP/PS1 转基因小鼠脑部神经炎症的影响Fig.6 Effects of sesamin on neuroinflammation in APP/PS1 transgenic mice brain

3 讨论

本研究发现芝麻素膳食补充可以改善APP/PS1 转基因小鼠的认知障碍。 此外，芝麻素还改善了由APP/PS1 转基因小鼠大脑的神经系统损害并增强了突触可塑性。 芝麻素通过降低小鼠大脑皮层中Aβ 的积累， 下调大脑皮层中炎症相关基因IBA-1 和IL-1β 的相对含量。 芝麻素激活了AKT并且上调IDE 基因和蛋白表达。

芝麻素的主要代谢过程为摄入后被肠吸收，然后在体内进一步代谢转化为邻苯二酚衍生物，并在肝脏中进一步转化为其葡萄糖醛酸或硫酸盐；此外，芝麻素自身可以通过全身循环后穿过血脑屏障[18-20]。 根据作者之前的研究，口服芝麻素治疗（50 mg/kg/d bw）可通过调节脑源性神经营养因子 （brain-derived neurotrophic factor， BDNF）表达来显著改善慢性和不可预测的轻度压力抑郁，如焦虑、 压力诱发的行为和心理障碍并改善突触功能[6-7]。 本试验中小鼠食用的芝麻素剂量（50 mg/kg）转化为人用的剂量为5.5 mg/kg，根据之前的文献报道，该剂量在安全剂量之内[21]。 在后续试验中可以考虑采用在安全范围的更高剂量探究是否有更明显的神经保护和改善认知作用。 本研究与之前的研究一致， 膳食补充芝麻素可减缓神经退行性变化中的认知功能障碍。

阿尔兹海默症最主要的一个病理学特征是Aβ 在大脑中过度积累。 Aβ 是一种含有39～43 个氨基酸的肽， 由APP 通过β-和γ-分泌酶的蛋白水解作用产生。 它可以由多种细胞产生， 并在血液、脑脊髓液和脑组织液中循环。 本研究中，虽然Aβ 聚集被芝麻素减少， 但有意思的是，APP 的表达被上调了， 对这一结果推测可能是裂解酶活性受到抑制，无法继续分解为Aβ，这需要在后续试验中继续检测这些相关酶的表达和活力。 在机体脑部中，IDE 能够通过水解Aβ 的方式，来减少Aβ的积累。有研究报道，在认知缺陷模型中通过激活蛋白激酶B（AKT）可增加IDE 的表达，对Aβ 发挥清除作用，从而起到神经保护作用[22]。 同样的，本研究显示，AKT 蛋白表达与IDE 基因和蛋白能被芝麻素上调（图7c～7e），同时芝麻素膳食补充能减少Aβ 的聚集（图5）有关。 然而，芝麻素如何激活AKT 信号通路， 是否与其改善胰岛素敏感性的生物活性相关，尚不清楚，需进一步研究。

图7 芝麻素对APP/PS1 转基因小鼠皮层APP、p-AKT 和IDE 蛋白表达的影响Fig.7 Effects of sesamin on the protein expression of APP， p-AKT and IDE in APP/PS1 transgenic mice cortex

神经炎症为神经退行性疾病的重要因素之一， 研究表明， 神经炎症会破坏中枢神经系统功能， 造成突触功能障碍及诱导脑内神经元细胞凋亡，对大脑的学习认知功能也会造成损伤，通过抑制神经炎症可以达到缓解神经退行性疾病的目的[23]。 先前研究表明，芝麻素可以通过激活核因子E2 相关因子2（Nrf2）抑制人骨关节炎软骨细胞中的炎症反应[24]。芝麻素还可以通过激活蛋白激酶B（AKT）和细胞外调节蛋白激酶（ERK）来增强Nrf2介导的结肠炎保护作用[25]。 此外，在人体以及动物试验中也报道了芝麻素具有一定的抗炎作用[24-26]。在一项糖尿病视网膜病变的动物研究中发现，芝麻素作为膳食补充剂可以降低视网膜上小胶质细胞标志物IBA-1 的表达[26]。而在本研究中，芝麻素同样显著抑制了小鼠大脑IBA-1 过度激活和IL-1β 在mRNA 水平的相对表达量（图6），这与先前的报道一致。 后续将探究芝麻素抑制神经炎症的具体分子机制。

综上， 膳食补充芝麻素增加了APP/PS1 转基因小鼠脑部突触功能相关蛋白表达， 减少了Aβ积累，改善了认知障碍。芝麻素的神经保护作用可能依赖于其抑制神经炎症并激活AKT/IDE 途径。本研究结果为芝麻素这种具有神经保护作用的食品功能组分在脑健康领域的研究和应用提供了理论依据。