绝对定量分析不同条锈病抗性小麦品种根际细菌群落结构

李菲 李欲轲 洪鲲 张宇斌 汤小辛

摘要：【目的】分析不同條锈病抗性小麦品种根际细菌群落的结构和功能差异，为开发防治小麦条锈病的环境友好方案提供理论基础和创新思路。【方法】以同一地块中对条锈病具有不同抗性的4个小麦品种（抗病品种贵农19和华麦1223，感病品种002和I19）为研究材料，采集不同抗性小麦品种根际土壤样品，采用绝对定量扩增子分析技术，研究抗病和感病小麦品种根际细菌的群落结构和功能。【结果】同一地块的4个小麦品种条锈病病情指数具有明显差异。4个小麦品种根际土壤细菌群落结构绝对定量分析表明，感病与抗病小麦品种的根际细菌群落分别聚类成独立的两类。感病小麦品种根际细菌群落丰度和多样性显著高于抗病小麦品种根际细菌群落（P<0.05）。坐标分析（PCoA）表明，所有小麦品种根际细菌群落按照抗病性不同分为两组;细菌群落功能分析表明，抗病小麦品种根际细菌群落具有更多的氨基酸和抗生素分泌功能。【结论】条锈病抗性对小麦根际细菌群落的影响超过小麦不同品种间遗传变异的影响。通过分析和挖掘不同条锈病抗性小麦品种的根际细菌群落，可开发出环境友好的小麦条锈病生物防治菌剂。

关键词： 小麦;条锈病;根际细菌群落;绝对定量

中图分类号： S435.121.43                       文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）05-1115-07

Abstract：【Objective】The structural and functional differences of rhizosphere bacterial communities of wheat cultivars with different stripe rust resistance levels were analyzed， which provided theoretical basis and innovative ideas for the development of environmentally friendly ways for the control of wheat stripe rust. 【Method】Four wheat cultivars（resistant cultivars Guinong 19 and Huamai 1223， susceptible cultivars 002 and I19） with different resistance levels to stripe rust in the same plot were collected. Rhizosphere soils samples were collected， and absolute quantitative amplicon analysis techniques was used to study the differences in rhizosphere bacterial community structure and function of resistant cultivars and susceptible cultivars. 【Result】There was obvious difference in stripe rust disease index among the four wheat cultivars in the same plot. The absolute quantitative analysis on rhizosphere bacterial community structure of the four wheat cultivars indicated that the rhizosphere bacterial community of resistant cultivars and susceptible cultivars clustered into two groups. Compared with the resistant varieties， the abundance and diversity of rhizosphere bacterial communities of stripe rust susceptible wheat were significantly higher（P<0.05）. Coordinate analysis（PCoA） analysis showed that the wheat cultivars could be divided into two groups according to the resistance. Functional analysis showed that the rhizosphere bacterial community of resistant wheat cultivars had more amino acids and antibiotic secretion functions. 【Conclusion】The effect of stripe rust resistance on the rhizosphere bacterial community of wheat cultivars exceed the genetic varia-tion among different wheat cultivars. Through analyzing rhizosphere bacterial community of wheat cultivars with different resistances can develop environmentally friendly biological control agent for wheat stripe rust.

Key words： wheat; stripe rust; rhizosphere bacterial community; absolute quantification

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（U1812401）

0 引言

【研究意义】小麦（Triticum spp.）是世界上种植面积最大的粮食作物，2018年种植面积约2.2亿ha，产量约7.6亿t，全球产量在玉米之后，排名第二（United States Department of Agriculture-Foreign Agricultural Service，2019）。小麦条锈病是影响小麦产量的重要因素，病原菌是担子菌门条形柄绣菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici条形柄锈菌小麦专化型，简称Pst）。Pst是专性活体营养的真菌，生长在寄主细胞间隙中，通过吸器从小麦细胞吸取养分。目前防治小麦条锈病主要依靠化学药剂和种植抗病品种。抗條锈病小麦品种由于对条锈菌具有小种的专化抗性，如过度集中使用，即长期大面积种植单一抗性品种，常会促使条锈病菌生理小种产生定向变异，进而产生新的毒力小种并克服品种的抗性，最后导致新的毒性小种大面积暴发流行，造成小麦产量损失，加大农业生产的风险。因此，开发环境友好的高效小麦条锈病控制方案，是小麦生产可持续发展的迫切需求。【前人研究进展】植物根系吸收水分和无机养分，并分泌各种有机质到土壤中（Hacquard et al.，2015）。植物根际的每克土壤中约含有数十亿个微生物，形成数万个不同的种类，因此，植物根际土壤被认为是一个高度复杂和动态的生态系统（Bulgarelli et al.，2013;Mendes et al.，2013;Phili-ppot et al.，2013）。目前已知植物共生微生物在植物应对病菌侵染中具有重要作用（Berg et al.，2016;Castrillo et al.，2017）。有学者从玉米（Planchamp et al.，2014）等农作物的根际分离筛选出根际菌株，并证明部分菌株可用于防治农作物病害。番茄品系对青枯病菌的不同抗性，部分原因是根际微生物不同所致（Kwak et al.，2018）。研究表明，植物根际促生细菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）能抑制植物根际有害微生物生长（Hu et al.，2018）。此外，PGPR还能诱导植物产生系统抗性，从而提高宿主植物整体的抗病能力（Pieterse et al.，2014）。目前常规16S扩增子测序在分析样本微生物组成时仅考虑微生物的相对丰度（比例），但微生物的相对丰度只表征了一个样本中微生物类群的相对比例。以往大多数研究用相对丰度来进行跨样本微生物丰度的比较，当样本间总微生物绝对含量存在差异时，可能会得出与事实相反的结论，所以通过一定手段获得微生物绝对丰度信息能为反映微生物群落结构及其动态变化提供更多有价值的参考信息（Smets et al.，2016）。Tkacz等（2018）比较了多个环境下相对定量和绝对定量扩增子分析的结果，发现会存在某一微生物种类绝对数量上升，而相对数量下降的情况。说明只有绝对定量分析才能反映样本每种微生物的真实数量变化和各组间样本的真实差异，绝对定量分析是微生态研究的首选方法（Smets et al.，2016;Tkacz et al.，2018）。【本研究切入点】根际微生物对宿主植株抗病能力的影响已有较多研究，但根际微生物对小麦条锈病抗性的影响目前尚无文献报道。【拟解决的关键问题】采用绝对定量扩增子测序的方法，对在同一地块中对条锈病表现不同抗性的小麦品系的根际微生物进行比较分析，研究小麦、条锈病菌和根际微生物群落之间的相互作用，为开发小麦条锈病防治的环境友好方案提供理论基础和创新思路。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

田间试验于国家小麦育种改良中心花溪实验站进行。该实验站位于我国西南部贵州省贵阳市花溪区，属亚热带季风气候，四季分明，冬无严寒、夏无酷暑，最冷月1月气温4～10 ℃，最热月7月气温25～28 ℃;雨量充沛，湿度较大，年均降水量1100～1300 mm。小麦条锈病菌在该地区过冬，为翌年在全国流行提供菌源。

本研究选择同一地块中对条锈病表现出不同抗性的4个小麦品种，感病和抗病品种各2个，分别为抗病品种贵农19和华麦1223，感病品种002和I19。小麦对条锈病抗感的病情指数使用0～9分评分（Line and Qayoum，1992）：高抗[R，0～3分，叶片无锈斑（0分）或很少（3分），无孢子堆（0分）或孢子堆很小（3分）]、中抗（MR，4～5分）、中感（MS，6分）和易感（S，7～9分，9分是指叶片孢子堆大而多，叶片黄色）。灌浆期采集4个小麦品种的根际土壤，每个小麦品种设3个生物学重复，共12个土壤样品。每个样品包括10～12株长势基本一致的小麦根际土壤。尽可能完整地挖出小麦植株的全部根系，轻柔晃动，把浮土甩掉，甩不掉的土壤认定为小麦的根际土壤，立即将样品带回实验室，使用灭菌200目筛对根际土壤进行筛虑。剔除筛后粉末中的细根和石子等，将所得土壤粉末保存于-80 ℃冰箱，待用。

1. 2 试验方法

将采集的根际土壤样品送至上海天昊生物技术公司进行绝对定量16S rRNA Miseq的扩增子测序。按照PowerSoil DNA试剂盒说明（MoBio，Carlsbad，USA）提取总基因组DNA。将具有至少4种不同浓度（内标的103、104、105和106个拷贝）的9种不同加标序列添加到样品DNA库中。加标序列由选择的天然16S rRNA基因和人工可变区相同的保守区组成，然后通过扩增细菌16S rRNA基因的V4～V5区域产生细菌扩增子文库。

1. 3 统计分析

使用TrimGalore 0.5.0（Babraham Bioinformatics，UK）和Mothur1.25.1（https：//www.mothur.org/）从raw reads中去除接头和引物序列。仅使用平均质量分数大于20且无模糊碱基的长度大于200 bp的序列进行随后的分析。这些序列聚类成操作分类单位（OTU），序列相似性为97%，然后滤出加标序列并对OTUs进行计量。使用Smets等（2016）和Tkacz等（2018）描述的R-3.2.2进行根际微生物绝对定量分析。使用Mothur1.25.1classify.seqs命令和RDP数据库进行OTUs分类（Cole et al.，2014）。热图、坐标分析图（PCoA）和平均链接层次聚类由R-3.2.2执行。

使用PICRUSt软件将条锈病抗病小麦和感病小麦根际土壤细菌群落的基因家族（功能）丰度表（KEGG）进一步汇总到更高水平的功能分类上。使用Welchs T-test对两个分组样本细菌群落KEGG功能条目的丰度进行差异比较，找出两组中具有显著差異的KEGG功能通路。

2 结果与分析

2. 1 小麦品种田间条锈病抗性调查结果

4个小麦品种均种植在国家小麦育种改良中心花溪实验站，数十年来，该地块种植的小麦均会发生条锈病。田间调查发现，该地块各小麦品种条锈病病情指数具有明显差异（图1）。其中贵农19和华麦1223表现出极强的抗条锈病能力，田间病情指数分值分别为2和1分;002和I19两个品种则严重感病，田间病情指数分值分别为8和9分。采集4个小麦品种的根际土壤进行绝对定量测序分析。

2. 2 小麦根际土壤细菌群落扩增子测序结果

去除模糊、短、低质量的reads和单独的OTU后，共有3688572个reads用于12个土壤样品的细菌群落分析。每个样本生成的OTU数量为3838～4735，并由RDP数据库进一步分类。基于内部加标标准及其衍生的标准曲线评估16S-seq数据的绝对量（如，R1样品的标准曲线公式为y=1.0342x-1.5416，其中，y表示以对数计的加入加标序列的拷贝数，x表示以对数观察到的OUT读数;所有拟合系数R2>0.99）。

微生物的相对丰度只表征一个样本中微生物类群的相对比例。与相对定量分析相比，绝对定量分析确定了每个微生物类群的绝对量，有利于不同样本间的比较。条锈病感病和抗病小麦品种根际土壤样本细菌群落相对和绝对定量聚类结果见图2。相对定量分析数据显示，小麦各品种间聚类较杂乱，感病小麦品种与抗病小麦品种未聚类在一起;绝对定量分析数据显示，感病小麦品种与抗病小麦品种分成独立的两类。

条锈病感病和抗病小麦品种根际土壤样本细菌群落相对定量和绝对定量比较见图3。与感病小麦品种（S）相比，抗病小麦品种（R）根际土壤中细菌的总丰度相对较小。绝对定量分析显示，与抗病小麦品种相比，感病小麦品种根际的变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）均显著升高（P<0.05，下同）;相对定量分析显示，感病小麦根际放线菌门（Actinobacteria）含量低于抗病小麦，但绝对定量分析显示，两种小麦的根际细菌群落中Actinobacteria的绝对量无显著差异（P>0.05，下同）。综上所述，因绝对定量分析数据能更准确地反映真实情况，使用绝对定量测序数据进行后续分析。

2. 3 小麦根际土壤细菌群落结构分析结果

感病小麦品种和抗病小麦品种的根际细菌群落具有明显不同的α多样性指数。与感病小麦品种相比，抗病小麦品种细菌群落OUT数目较少，Chao1、ACE和Shannon指数均低于感病小麦品种，群落多样性较低;感病小麦品种根际细菌群落具有更多的OUT数目和更高的群落多样性（图4）。

根据PCoA（在Weighted UniFrac上计算，图5-A）和平均连锁分层聚类（UPGMA，在Bray-Curtis上计算，图5-B），感病小麦品种与抗病小麦品种根际细菌群落在PCo1（67.98%）水平上明显分开。感病和抗病小麦品种内部，细菌群落结构的差异不明显，说明条锈病抗性的差异对小麦植株根际细菌群落结构具有显著影响，且其影响大于小麦不同品种间基因型差异的影响。

2. 4 抗病相关细菌群落功能分析结果

使用Welchs T-test对感病小麦品种和抗性小麦品种两组样本细菌群落KEGG功能条目的丰度进行差异比较，找出两组中具有显著差异的功能。通过初步分析，发现134个KEGG（KO） term在感病小麦品种和抗病小麦品种间存在显著差异。

在抗病小麦品种的根际细菌群落中，多个KEGG功能条目具有更高的丰度值，包括转运蛋白、链霉素的生物合成、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成等。植物病原体相互作用等KEGG途径功能条目在感病小麦中具有更高的丰度值（图6）。

3 讨论

植物根际土壤是一个高度复杂和动态的生态系统（Bulgarelli et al.，2013;Mendes et al.，2013;Philippot et al.，2013）。已有充分的研究证明生长在盐、旱、热、重金属和病菌、害虫侵害等不利环境中的植物，其对逆境的适应能力部分甚至全部来自于与其共生的微生物（Zhou et al.，2015;Raza et al.，2016;Wang et al.，2016;Yuan et al.，2016）。温室和野外试验均证实，如果去除关键的内生菌，某些耐逆境植物不再能够适应原本生存的不利环境（Redman et al.，2002）。有科学家提出，自然界中植物的表型是植物基因组和根际/体内广泛存在的微生物协同作用的产物（Vandenkoornhuyse et al.，2015）。

目前对小麦条锈病抗性的研究主要集中在抗病种质和基因的挖掘，忽略了小麦健康的一个重要影响因素——根际微生物。高通量测序技术极大地方便了人们对植物根际微生物群落结構和功能的研究。针对模式植物拟南芥和农作物水稻、玉米、小麦的研究发现，土壤理化性质、植物发育阶段和基因型是影响植物根际细菌群落结构的主要因素（Bulga-relli et al.，2012;Lundberg et al.，2012;Mahoney et al.，2017），但对不同小麦品种间根际细菌群落结构的差异尚无研究报道。

对同一地块不同条锈病抗性小麦品种根际微生物进行比较分析发现，与抗病小麦品种相比，感病小麦品种根际细菌群落丰度增加，多样性增加。功能分析表明，抗病小麦根际细菌群落具有分泌更多氨基酸（包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等）和抗生素（如链霉素）的功能。抗条锈病小麦品种与感条锈病小麦品种的根际细菌群落存在显著差异，其影响大于小麦品种基因型的影响。因此，进一步挖掘抗病小麦品种根际的有益细菌，提高小麦根际抗生素分泌功能，应可显著改善小麦植株的抗条锈病能力。这一结果为开发小麦条锈病防治的环境友好方案提供了理论基础和创新思路。

4 结论

通过采集同一地块中对条锈病具有不同抗性的4个小麦品种根际细菌群落进行绝对定量扩增子分析，发现条锈病抗性对小麦根际细菌群落的影响超过小麦不同品种间遗传变异的影响;通过分析和挖掘不同条锈病抗性小麦品种的根际细菌群落，可开发出环境友好的小麦条锈病生物防治菌剂。

参考文献：

Berg G，Rybakova D，Grube M，K?berl M. 2016. The plant microbiome explored： Implications for experimental botany[J]. Journal of Experimental Botany，67（4）：995-1002.

Bulgarelli D，Rott M，Schlaeppi K，Van Themaat E V L，Ahmadinejad N，Assenza F，Rauf P，Huettel B，Reinhardt R，Schmelzer E，Peplies J，Glockner F O，Amann R，Eickhorst T，Schulze L P. 2012. Revealing structure and asse-mbly cues for Arabidopsis root-inhabiting bacterial microbiota[J]. Nature，488（7409）：91-95.

Bulgarelli D，Schlaeppi K，Spaepen S，Van Themaat E V，Schulze-Lefert P. 2013. Structure and functions of the bacterial microbiota of plants[J]. Annual Review of Plant Biology，64（1）：807-838.

Castrillo G，Teixeira P J，Paredes S H，Law T F，De Lorenzo L，Feltcher M E，Dangl J L. 2017. Root microbiota drive direct integration of phosphate stress and immunity[J]. Nature，543（7646）：513-518.

Cole J R，Wang Q，Fish J A，Chai B，Mcgarrell D M，Sun Y，Tiedje J M. 2014. Ribosomal database project： Data and tools for high throughput rRNA analysis[J]. Nucleic Acids Research，42：633-642.

Hacquard S，Garrido-Oter R，Gonzalez A，Spaepen S，Ackermann G，Lebeis S L，Schulze-Lefert P. 2015. Microbiota and host nutrition across plant and animal kingdoms[J]. Cell Host & Microbe，17（5）：603-616.

Hu L，Robert C A M，Cadot S，Zhang X，Ye M，Li B，Manzo D，Chervet N，Steinger T，Van Der Heijden M G A，Schlaeppi K，Erb M. 2018. Root exudate metabolites drive plant-soil feedbacks on growth and defense by shaping the rhizosphere microbiota[J]. Nature Communications，doi： 10.1038/s41467-018-05122-7.

Kwak M J，Kong H G，Choi K，Kwon S K，Song J Y，Lee J，Kim J F. 2018. Rhizosphere microbiome structure alters to enable wilt resistance in tomato[J]. Nature Biotechno-logy，36（11）：1100-1109.

Line R F，Qayoum A. 1992. Virulence，aggressiveness，evolution and distribution of races of Puccinia striiformis（the cause of stripe of wheat） in North America，1968—1987[J]. Technical Bulletin，1788：44.

Lundberg D S，Lebeis S L，Paredes S H，Yourstone S，Gehring J，Malfatti S A，Dangl J L. 2012. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome[J]. Nature，488（7409）：86-90.

Mahoney A K，Yin C T，Hulbert S H. 2017. Community structure，species variation，and potential functions of rhizosphere-associated bacteria of different winter wheat（Triticum aestivum） cultivars[J]. Frontiers in Plant Science，8：132.

Mendes R，Garbeva P，Raaijmakers J M. 2013. The rhizosphere microbiome： Significance of plant beneficial，plant pathogenic，and human pathogenic microorganisms[J]. Fems Microbiology Reviews，37（5）：634-663.

Philippot L，Raaijmakers J M，Lemanceau P，Der Putten W H. 2013. Going back to the roots： The microbial ecology of the rhizosphere[J]. Nature Reviews Microbiology，11（11）：789-799.

Pieterse C M J，Zamioudis C，Berendsen R L，Weller D M，Van Wees S C，Bakker P A H M. 2014. Induced systemic resistance by beneficial microbes[J]. Annual Review of Phytopathology，52（1）：347-375.

Planchamp C，Glauser G，Mauch-Mani B. 2014. Root inoculation with Pseudomonas putida KT2440 induces transcriptional and metabolic changes and systemic resistance in maize plants[J]. Frontiers in Plant Science，5：719.

Raza W，Ling N，Yang L D，Huang Q W，Shen Q R. 2016. Response of tomato wilt pathogen Ralstonia solanacearum to the volatile organic compounds produced by a biocontrol strain Bacillus amyloliquefaciens SQR-9[J]. Scienti-fic Reports，6（1）：24856.

Redman R S，Sheehan K B，Stout R G，Rodriguez R J，Henson J M. 2002. Thermotolerance generated by plant/fungal symbiosis[J]. Science，298（5598）：1581.

Smets W，Leff J W，Bradford M A，Mcculley R L，Lebeer S，Fierer N. 2016. A method for simultaneous measurement of soil bacterial abundances and community composition via 16S rRNA gene sequencing[J]. Soil Biology & Biochemistry，96：145-151.

Tkacz A，Hortala M，Poole P S. 2018. Absolute quantitation of microbiota abundance in environmental samples[J]. Microbiome，6（1）：1-13.

United States Department of Agriculture-Foreign Agricultural Service. 2019. World Agriculture Production Report 2019. [2019-04-20]. https：//www.fas.usda.gov/data/world-agricultural-production.

Vandenkoornhuyse P，Quaiser A，Duhamel M，Van A L，Dufresne A. 2015. The importance of the microbiome of the plant holobiont[J]. New Phytologist，206（4）：1196-1206.

Wang J L，Li T，Liu G Y，Smith J M，Zhao Z W. 2016. Unrave-ling the role of dark septate endophyte（DSE） colonizing maize（Zea mays） under cadmium stress： Physiological，cytological and genic aspects[J]. Scientific Reports，6（1）：22028.

Yuan Z L，Druzhinina I S，Labbe J，Redman R S，Qin Y，Rodriguez R J，Lin F C. 2016. Specialized microbiome of a halophyte and its role in helping non-host plants to withstand salinity[J]. Scientific Reports，6（10）：32467.

Zhou W N，White J F，Soares M A，Torres M S，Zhou Z P，Li H Y. 2015. Diversity of fungi associated with plants growing in geothermal ecosystems and evaluation of their capacities to enhance thermotolerance of host plants[J]. Journal of Plant Interactions，10（1）：305-314.

（責任编辑 麻小燕）