响应面法优化藜麦麸皮皂苷酸水解工艺

杨 洁 王海丽 赵三虎 范建凤 赵二劳

(忻州师范学院化学系，忻州 034000)

藜麦(ChenopodiumquinoaWilld)又称南美藜、藜谷等，营养丰富而独特，被誉为“营养黄金”、“超级谷物”[1]。藜麦原产于南美洲安第斯山区[2]，我国1987年开始引种，现已在山西、陕西、青海和四川等地规模化种植[3,4]，资源较为丰富。藜麦中含有皂苷，且藜麦麸皮中皂苷含量更高[5,6]，藜麦皂苷具有清除自由基的抗氧化活性[7，8]。因此，研究藜麦麸皮皂苷的提取及有效提高其抗氧化活性的方法，对于藜麦麸皮皂苷的精深开发应用具有重要的实际意义。

目前，有关藜麦皂苷的研究较多，且主要集中于提取纯化工艺及其生物活性上，如黄金等[9]研究了藜麦籽粒皂苷乙醇浸提工艺；梁霞等[10]研究了藜麦总皂苷的乙醇回流提取工艺；赵亚东等[9]研究了青海藜麦中皂苷超声辅助乙醇提取及其抗氧化活性；杨洁等[7]研究了藜麦皮皂苷的微波辅助提取及其抗氧化活性；赵文婷[11]研究了藜麦麸皮总皂苷乙醇回流提取及其抗氧化和免疫增强作用；而嵇丽红等[12]则研究了不同水解方法对藜麦皂苷抑菌活性及酪氨酸酶抑制作用的影响。但有关藜麦麸皮皂苷酸水解对抗氧化活性的影响研究鲜见报道。基于此，本研究以DPPH·清除率为指标，盐酸浓度、液液比、水解温度和水解时间为因素，采用响应面法优化藜麦麸皮皂苷酸水解工艺，并比较藜麦皂苷酸水解前后清除DPPH·能力及抗氧化活性，为藜麦皂苷用于抗氧化剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

藜麦麸皮：山西华青藜麦产品开发有限公司。以石油醚脱脂，烘箱中60 ℃烘干，粉碎过60目筛，装瓶保存备用。

DPPH(1,1-二苯基-2-苦肼基)标准品；盐酸、氢氧化钠、氨水和无水乙醇等均为分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

V-1100D型可见分光光度计； PHS-3C型智能酸度计；LWMC-201型电脑微波化学反应器。

1.3 方法

1.3.1 藜麦皂苷提取液的制备

采用微波辅助提取藜麦麸皮中的皂苷[7]。准确称取5.0 g藜麦麸皮置于250 mL圆底烧瓶中，加入150 mL体积分数68%的乙醇溶液，微波功率455 W，微波时间10 min，提取3次，合并提取液，旋转蒸发仪浓缩至100 mL，冰箱保存备用。

1.3.2 对DPPH·清除率的测定

藜麦麸皮皂苷及其水解液对DPPH·清除率的测定参考文献的方法进行[7,13,14]。量取1.0 mL质量浓度为 0.1 mg/mL的DPPH溶液于比色管中，再加入待测液0.2 mL，用68%无水乙醇定容至5 mL，摇匀，室温下避光反应30 min后，在最大波长517 nm处测量其吸光度值为A1；测定不加待测液仅DPPH溶液吸光度为A0；测定不加DPPH溶液仅待测溶液的吸光度为A2。藜麦麸皮皂苷及其水解液对DPPH·清除率按公式计算。

1.3.3 藜麦麸皮皂苷酸水解工艺流程

藜麦麸皮皂苷提取液→加盐酸→恒温水解→水解液冷却→调pH→定容→测定

主要技术参数：藜麦麸皮皂苷提取液2.5 mL，水解液水浴冷却至室温，氨水调水解液pH为中性，定容体积25 mL，测定体积0.2 mL，其余按实验设计。

1.3.4 藜麦麸皮皂苷酸水解单因素实验

盐酸浓度对藜麦麸皮皂苷酸水解的影响：液液比1∶3(mL/mL)，水解温度70 ℃，分别在盐酸浓度为1.2、2.5、4.8、6.6、8.4 mol/L条件下水解1.0 h，以藜麦麸皮皂苷水解液对DPPH·清除率为指标，确定最适藜麦麸皮皂苷酸水解的盐酸浓度。

液液比对藜麦麸皮皂苷酸水解的影响：水解温度70 ℃，盐酸浓度4.8 mol/L，分别在液液比为1∶1.8、1∶2.4、1∶3、1∶3.6、1∶4.2(mL/mL)的条件下水解1.0 h，以藜麦麸皮皂苷水解液对DPPH·清除率为指标，确定最适藜麦麸皮皂苷酸水解的液液比。

水解温度对藜麦麸皮皂苷酸水解的影响：液液比为1∶3(mL/mL)，盐酸浓度4.8 mol/L，分别在水解温度为50、60、70、80、90 ℃的条件下水解1.0 h，以藜麦麸皮皂苷水解液对DPPH·清除率为指标，确定最适藜麦麸皮皂苷酸水解的水解温度。

水解时间对藜麦麸皮皂苷酸水解的影响：在液液比1∶3(mL/mL)，水解温度70 ℃，盐酸浓度4.8 mol/L的条件下，分别水解1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，以藜麦麸皮皂苷水解液对DPPH·清除率为指标，确定最适藜麦麸皮皂苷酸水解的水解时间。

1.3.5 响应面法优化藜麦麸皮皂苷酸水解工艺

根据单因素实验结果，以盐酸浓度(A)、液液比(B)、水解温度(C)、水解时间(D)为自变量，藜麦皂苷水解液对DPPH·清除率为响应值(Y)，采用Box-Behnken设计实验，由模型分析实验结果，确定最佳水解工艺条件。响应面设计因素与水平如表1所示。

表1 响应面设计因素与水平

1.3.6 藜麦麸皮皂苷酸水解产物推测

采用薄层色谱法进行藜麦麸皮皂苷酸水解产物推测[15，16]。实验所用的正相展开剂为三氯甲烷∶甲醇=6∶1，反相展开剂为甲醇∶水=2.7∶1，显色剂为浓硫酸∶无水乙醇=1∶9。

1.3.7 数据处理

指标数据均为3次平行测定值，作图采用Origin 8.0软件，数据分析采用SPSS软件进行，P<0.01为差异极显著；P<0.05为差异显著；P>0.05为差异不显著。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

图1 皂苷酸水解单因素实验

各因素对藜麦麸皮皂苷酸水解影响结果见图1。随着水解盐酸浓度的增加，皂苷水解液对DPPH·的清除率先增后减，当盐酸浓度为6.6 mol/L时，皂苷水解液对DPPH·的清除率最高，为50.43%。当盐酸浓度低于6.6 mol/L时，增加盐酸浓度有利于皂苷糖链的断裂，产生系列相应的次级皂苷或者皂苷元，使水解液清除DPPH·的能力升高；当盐酸浓度大于6.6 mol/L后，可能由于溶液中氯离子浓度偏高，使水解成的部分皂苷元转化为羟基氯代物，导致水解液清除DPPH·的活性降低[17]。因此选择盐酸浓度为6.6 mol/L为最适工艺条件。

随着液液比的增加，皂苷水解液对DPPH·的清除率先增大后减小。当液液比小于1∶2.4(mL/mL)时，随着液液比中盐酸量的增加，从而使皂苷酸水解程度增加，皂苷水解液清除DPPH·能力增强；当液液比为1∶2.4(mL/mL)时，皂苷水解液DPPH·清除率最大。当液液比大于1∶2.4(mL/mL)，皂苷水解液清除DPPH·能力降低，其原因可能是水解液中存在的蛋白、淀粉等杂质影响水解进行[17,18]，抑制了皂苷水解，导致皂苷水解液清除DPPH·能力减弱。因此，选择液液比1∶2.4(mL/mL)为最适工艺条件。

随着水解温度的升高，皂苷水解液对DPPH·的清除率先增后减，在水解温度为80 ℃时，皂苷水解液对DPPH·的清除率达到最大，为57.0%。当水解温度小于80 ℃时，随水解温度的升高，分子热运动加剧，单位体积内皂苷分子与盐酸分子相互碰撞的机会增多，促进了皂苷水解反应的发生，皂苷水解液对DPPH·的清除率增大；当水解温度大于80 ℃时，可能由于温度过高，水解产物中皂苷元等发生转化，减少皂苷元类物质的生成[18]，导致水解液对DPPH·的清除率降低，因此选择水解温度80 ℃为最适工艺条件。

水解初期反应进行较快，随着水解时间增加，皂苷水解液对DPPH·的清除率逐渐增加，当水解时间为2.0 h时，皂苷水解液对DPPH·的清除率达到最大，为59.83%。当水解时间大于2.0 h后，再延长水解时间，皂苷水解液对DPPH·的清除率降低。其原因可能是水解初期，随时间增加，皂苷与盐酸分子接触时间增长，使得水解逐渐趋于完全，水解液中皂苷元等增加，水解液对DPPH·的清除率增加；当水解时间大于2.0 h后，可能由于水解时间过长，产生的皂苷元部分发生脱水、环合、双键移位、取代基移位、构型转化等结构发生变化[19]，使得皂苷水解液对DPPH·的清除率降低。因此选择水解时间2.0 h为最适工艺条件。

2.2 响应面优化藜麦麸皮皂苷酸水解工艺

2.2.1 响应面实验设计及结果

根据单因素实验，以水解液对DPPH·的清除率为响应值(Y)，盐酸浓度(A)、液液比(B)、水解温度(C)和水解时间(D)为因素，按Box-Behnken设计实验，进行四因素三水平的响应面实验，优化藜麦麸皮皂苷酸水解工艺，实验设计及结果见表2。

2.2.2 响应面回归模型及方差分析

利用Design-Expert V8.0.6软件对表2响应面

表2 响应面实验设计及结果

实验结果进行多元回归拟合和方差分析。拟合的二次多项回归模型方程为：Y=0.64+0.01A+3.450×10-0.03B+0.016C+0.035D-0.011AB-0.019AC-0.047AD+6.875×10-0.03BC-0.020BD-0.019CD-6.708×10-0.03A2-6.008×10-0.03B2-0.052C2-0.015D2，从回归方程系数可以看出，各因素对响应值影响的大小顺序为：D(水解时间)>C(水解温度)>A(盐酸浓度)>B(液液比)。对回归模型的方差分析结果见表3。

由表3方差分析可知，实验拟合的二次多项回归模型具有高度的显著性(P<0.000 1)，模型失拟项P=0.430 2>0.05，不显著，说明建模成功，实验结果可用该模型描述。模型的决定系数R2=0.974 7，说明响应值的变化有97.47%来源于所选因素，该模型与实际情况接近，实验拟合程度良好，实验误差小，能充分反映各因素与响应值间的关系。变异系数CV=1.6%<5%，说明模型的置信度较高，重现性较好，实验设计合理。因此可以用该模型对实验结果进行分析和预测。由表3还可看出，盐酸浓度、水解温度和水解时间的一次项，水解温度和水解时间的二次项，以及盐酸浓度与水解温度、盐酸浓度与水解时间、液液比与水解时间、水解温度与水解时间的交互项对响应值的影响都达到极显著水平(P<0.01)，盐酸浓度与液液比的交互项对响应值的影响达到显著水平(P<0.05)，说明各因素对响应值的影响较为复杂，不是简单的线性关系，而应是抛物面关系。由表3中各因素F值的大小可知，各因素对藜麦麸皮皂苷酸水解物清除DPPH·能力影响的大小顺序为：水解时间> 水解温度> 盐酸浓度> 液液比，这与利用模型方程系数分析的结果一致。

表3 回归模型方差分析

注：*差异显著，P<0.05；**差异极显著，P<0.01。

2.2.3 因素间交互作用分析

根据回归方程得出不同因子交互作用的响应面分析图以及等值线图如图2～图7所示。

观察各因素间交互作用的响应面图形，若响应曲面坡度越弯曲，则响应值对于因素的改变越敏感，相反曲面越平缓，则响应值对于因素的改变越迟钝[20]；等高线图的形状可反映交互作用的强弱，等高线图形越椭圆，表示交互作用越显著[21]。从图2～图7可以直观地看出，AC、AD、BD、CD即盐酸浓度与水解温度、盐酸浓度与水解时间、液液比与水解时间、水解温度与水解时间的交互项对响应值的影响显著，这与模型的方差分析结果一致。

图2 盐酸浓度与液液比交互作用的响应面图与等高线图

图3 盐酸浓度与水解温度交互作用的响应面图与等高线图

图4 盐酸浓度与水解时间交互作用的响应面图与等高线图

图5 液液比与水解温度交互作用的响应面图与等高线图

2.2.4 最佳工艺条件与验证

根据拟合模型方程得到藜麦麸皮皂苷酸水解的最优条件为：盐酸浓度4.85 mol/L，液液比1∶1.91(mL/mL)，水解温度为80.52 ℃，水解时间为2.49 h。根据实验操作的具体情况，各参数调整为：盐酸浓度

图6 液液比与水解时间交互作用的响应面图与等高线图

图7 水解温度与水解时间相互影响的响应面图与等高线图

4.8 mol/L，液液比1∶2(mL/mL)，水解温度80 ℃，水解时间2.5 h。在此工艺条件下，进行5次平行验证实验，取其平均值，得到藜麦麸皮皂苷水解物对DPPH·的清除率为68.84%，由回归方程计算得藜麦麸皮皂苷水解物对DPPH·的理论清除率为69.14%，与理论预测值的相对误差为0.43%，表明结果可靠，验证了拟合模型的可行性。

2.3 DPPH·清除率比较

在藜麦麸皮皂苷相同浓度下，比较酸水解前后皂苷液对DPPH·的清除率，5次平行实验测得水解前皂苷液对DPPH·的清除率平均为22.8%，水解后皂苷液对DPPH·清除率平均为68.8%，显著检验表明，水解前后皂苷液对DPPH·清除率存在极显著差异(P<0.01)，藜麦麸皮皂苷经酸水解后其清除DPPH·的能力及抗氧化活性极显著提高。酸水解可有效提高藜麦麸皮皂苷清除自由基及抗氧化活性。

2.4 藜麦皂苷酸水解产物推测

对藜麦麸皮皂苷酸水解产物进行薄层色谱分析，结果如图8所示。藜麦麸皮皂苷水解后产物在正相薄层色谱板(图8a中A)上方、反相薄层色谱板(图8b中A)下方，表明水解产物极性相对水解前皂苷极性更小。另外，比较图8中A与C可发现，藜麦麸皮皂苷经过酸水解后，产物的极性介于苷元(齐墩果酸)和2个双糖及2个三糖基皂苷之间。表明经酸水解后，藜麦麸皮皂苷可能生成了极性较小的单糖苷或者其他苷元。推测这些极性更小的次级皂苷以及皂苷元清除DPPH·的能力即抗氧化能力强于藜麦皂苷，导致藜麦麸皮皂苷酸水解后抗氧化活性增强。

注：A：皂苷酸水解后；B：皂苷酸水解前；C：5种皂苷类单体(齐墩果酸、3-O[-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤苷元]-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、3-O-[α-L-吡喃阿拉伯糖美商陆酸]-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、3-O-[β-D- glucopyranosyl-(1→3)-O-α-L-吡喃阿拉伯糖美商陆酸]-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、3-O-[β-D-glucopyranosyl- (1→3)-O-α-L-吡喃阿拉伯糖常春藤苷元]-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷)。

图8薄层色谱图

3 结论

以DPPH·清除率为指标，在单因素实验的基础上，以盐酸浓度、液液比、水解温度和水解时间为因素，采用响应面法优化了藜麦麸皮皂苷酸水解工艺。结果表明，影响藜麦麸皮皂苷酸水解的因素大小顺序为：水解时间> 水解温度> 盐酸浓度> 液液比，优化的藜麦麸皮皂苷酸水解最佳工艺条件：盐酸浓度4.8 mol/L，液液比1∶2(mL/mL)，水解温度80 ℃，水解时间2.5 h。在该工艺条件下，藜麦麸皮皂苷酸水解物对DPPH·清除率显著高于酸水解DPPH·清除率。表明酸水解可有效提高藜麦麸皮皂苷清除自由基抗氧化活性。但本实验仅对藜麦麸皮皂苷酸水解后可有效提高清除DPPH·能力进行了研究，而有关藜麦麸皮皂苷酸水解产物为何种皂苷元，以及何种皂苷元起到清除自由基的抗氧化作用还有待深入研究。