常见泪腺上皮性肿瘤中EGFL7的表达及其与血管生成和细胞增殖活性的相关性研究

邢其棋，张 芳，刘 栋，刘夫玲

0引言

肿瘤发生侵袭转移是一个多环节、多步骤的动态过程，涉及肿瘤细胞的黏附、降解、移动和血管生成、增殖等事件。类表皮生长因子结构域7(epidermal growth factor like domain7，EGFL7)的研究涉及血管形成过程中的关键性作用。本文拟检测常见泪腺上皮性肿瘤中EGFL7的表达，及其与微血管密度(microvascular density，MVD)、肿瘤细胞增殖活性(Ki67)的相关性。为肿瘤的预后判定及抗血管生成治疗提供新的探索。

1材料和方法

1.1材料收集2009-01/2019-01青岛市市立医院住院手术患者10例正常泪腺组织(正常泪腺组织取自因炎性假瘤、Mikulicz病等良性泪腺肿瘤切除后，标本中的部分正常泪腺组织)和46例泪腺上皮性肿瘤患者，术后病理分别为泪腺多形性腺瘤20例、多形性腺癌12例、腺样囊性癌14例。主要试剂：兔抗EGFL7单克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，鼠抗CD34单克隆抗体、鼠抗Ki67单克隆抗体(中杉金桥生物技术有限公司)。本研究经我院伦理委员会审批通过,所有患者均知情同意。

1.2方法采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(streptavidin-peroxidase，SP)，行高温高压修复抗原处理，染色步骤按SP试剂盒提供的说明书进行。用磷酸盐缓冲盐液(PBS)替代一抗作阴性对照，用已知阳性切片作阳性对照。

评定标准：EGFL7染色判定标准参照 Shimizu等[1]曾描述的方法进行评定和积分。由两位高年资病理科医师独立完成高倍镜下观察每张切片单个视野内染色阳性细胞及比例计数。根据阳性细胞占同类细胞总数的百分率及细胞染色强度综合判定。具体为：(1)染色强度评分标准：细胞浆不显色，0分；胞浆呈淡黄色，1分；胞浆呈棕黄色，2分；胞浆呈棕褐色，3分。(2)阳性细胞所占比例评分标准：阳性细胞数≤10%，记为0分；10%～<40%，记为1分；40%～<70%，记为2分；≥70%，记为3分。(3)染色强度评分+阳性细胞所占比例评分=总评分；总积分0～1分为阴性，大于2分为阳性；<2分为(-)，2～3分(+)，4～5分(++)，>5分(+++)。Ki67是以细胞核染成均一的棕褐色，胞浆及胞膜不着色为阳性细胞。随机选取5个高倍镜视野，每个视野计算100个肿瘤细胞的阳性细胞数，取其均值为Ki67指数(Ki67LI)。微血管密度(MVD)的测定参照Weidner建议的方法[2]：CD34阳性染色以血管内皮细胞胞质及胞膜出现棕黄色颗粒沉着为阳性，计数微血管染色(CD34)呈棕黄色的单个或成簇细胞群，计数时需要排除管腔直径大于8个红细胞的或管壁肌层较厚的微血管。计数时先用低倍镜找出3个微血管最密集的区域，然后再用200倍镜在上述3个视野中分别计数微血管数，最后取其平均值即为该肿瘤组织的微血管密度值。

2结果

2.1 EGFL7在正常泪腺及常见泪腺上皮性肿瘤中的表达情况EGFL7的阳性表达为细胞质呈棕黄色或棕褐色着色(图1)，主要表达在泪腺多形性腺癌与腺样囊性癌的肿瘤细胞中，EGFL7在12例多形性腺癌中的阳性表达率为83%(10/12)，其中弱阳性率为17%(2/12)，中等阳性率为42%(5/12)，强阳性率为25%(3/12)(表1)，在14例腺样囊性癌中的阳性表达率为86%(12/14)，其中弱阳性率为21%(3/14)，中等阳性率为36%(5/14)，强阳性率为29%(4/14)。而在多形性腺瘤及正常泪腺组织中几乎无阳性表达。采用Fisher确切概率法检验统计分析，结果显示EGFL7在腺样囊性癌及多形性腺癌中的表达明显高于多形性腺瘤及正常泪腺组织中的表达，且具有统计学意义(P<0.001)，而在正常组织与多形性腺瘤中的表达无明显统计学意义(P=1.000)，同样在腺样囊性癌与多形性腺癌中的表达无明显统计学意义(P=1.000)，见表1。

2.2 MVD在常见泪腺上皮性肿瘤中的表达情况CD34相关抗原染色后，可以看到在切片组织中的肿瘤微血管染色呈棕黄色的单个或成簇细胞群(图2)。腺样囊性癌组织中的微血管密度为(43.43±4.60)、多形性腺癌(32.58±14.46)，显著高于多形性腺瘤(4.20±1.19)。采用方差分析结果显示，在常见泪腺上皮性肿瘤中MVD的表达差异具有统计学意义(P<0.001)。组间两两比较的结果显示MVD在腺样囊性癌及多形性腺癌中的表达明显高于多形性腺瘤，且差异有统计学意义(P<0.001)，而在腺样囊性癌与多形性腺癌之间无明显统计学差异(P=0.822)。

图1EGFL7在多形性腺癌和腺样囊性癌中的表达情况A: EGFL7在多形性腺癌中的表达(+)(10×10, IHC); B:EGFL7在多形性腺癌中的表达(+)(10×40, IHC); C:EGFL7在腺样囊性癌中的表达(+)(10×10, IHC); D: EGFL7在腺样囊性癌中表达(+)(10×40, IHC)。

图2CD34在腺样囊性癌和多形性腺癌中的表达A:CD34在腺样囊性癌中的表达(10×20, IHC); B:CD34在多形性腺癌中的表达(10×20, IHC)。

图3Ki67在腺样囊性癌和多形性腺癌中的表达A:Ki67在腺样囊性癌中的表达(10×10, IHC); B:Ki67在多形性腺癌中的表达(10×10, IHC)。

表1 常见泪腺上皮性肿瘤及正常泪腺中EGFL7蛋白的表达例

2.3 Ki67在常见泪腺上皮性肿瘤及正常泪腺中的表达Ki67相关抗原染色后，我们可以观察到，该抗原在所有分组中均有不同程度的表达，阳性细胞表现为细胞核呈棕褐色(图3)。采用Ki67指数(Ki67LI)表示Ki67在组织中的表达情况。在泪腺多形性腺癌中的Ki67表达量最高为(44.83±13.68)，其次是腺样囊性癌(26.29±8.44)，在泪腺多形性腺瘤(2.80±3.14)及正常泪腺组织(0.40±0.70)中亦有少量表达。采用方差分析结果显示，在常见泪腺上皮性肿瘤及正常泪腺组织中Ki67的表达差异具有统计学意义(P<0.001)。且组间两两比较均具有明显的统计学差异(P<0.001)。

2.4常见泪腺上皮性肿瘤中EGFL7的表达水平与MVD及Ki67的关系经Spearman等级相关分析发现，在常见泪腺上皮性肿瘤中EGFL7的表达水平与MVD的表达呈明显正相关(rs=0.897，P<0.001)，与Ki67的表达呈明显正相关(rs=0.837，P<0.001)，见表2。

等级例数CD34Ki67LI-236.19±8.005.81±6.16+631.33±8.1425.67±5.51EGFL7++1037.70±11.4537.80±2.39+++745.71±14.2848.00±5.03

3讨论

EGFL7属于一个小基因家族，是由Fitch等[3]和Nichol等[4]首次发现，EGFL7高表达与胚胎发育早期，并证实了其在胚胎过程中主要介导引起内皮细胞运动并迁移到正确的位置形成血管管腔，缺乏EGFL7的表达可导致胚胎血管管腔形成障碍[5]。EGFL7被血管内皮细胞分泌后停留在其附近，表明其可能跟细胞外基质相关，介导细胞间相互作用[6-8]。目前研究发现EGFL7在多种人类恶性肿瘤中均有表达[9-10]，包括肺癌、胶质瘤[11]、结直肠癌、肝癌[10]、胃癌[12]、乳腺癌、前列腺癌、食道癌、卵巢癌[13]和肾癌[14]。EGFL7在各种肿瘤中的表达升高已被证明它在肿瘤的新生血管生成、肿瘤增殖及侵袭中发挥核心作用[15]。此外，近年来的研究表明，EGFL7还具有促进肿瘤细胞迁徙、上皮间质转化[16]、免疫逃逸[17]等作用。

血管生成在病理条件下，这一过程将导致疾病的进展与增殖，例如，肿瘤的持续快速生长需要血管生成平衡向原血管生成因子倾斜，以保证肿瘤有足够的营养供应[18]。肿瘤增殖生长与有丝分裂活性有关[19]，许多来自细胞核细胞周期分析的报告显示，Ki67存在于细胞周期的G1、S和G2阶段，这暗示了它在许多肿瘤中作为细胞增殖标志物的作用[20]。

在此前，有研究发现[20]，在脑胶质瘤中发现Ki67与MVD呈显著正相关，且与肿瘤分级呈正相关，说明该研究支持增殖活性依赖于血管生成水平。EGFL7的表达也与Ki67呈正相关[21]，且提示EGFL7的上调与肿瘤的增殖和侵袭密切相关。Xu等[22]研究发现，在靶向抑制了EGFL7的表达以后肿瘤的生长速度变慢，增殖活性降低，这进一步说明EGFL7的表达与肿瘤的增殖活性有密切关系。

在本实验研究中，应用免疫组化技术检测了EGFL7在常见泪腺上皮性肿瘤组织中的表达水平。发现EGFL7在正常泪腺组织和多形性腺瘤中几乎没有表达，而在多形性腺癌及腺样囊性癌中显著表达。使用CD34抗体标记常见泪腺上皮性肿瘤中的微血管，结果显示，在腺样囊性癌及多形性腺癌组织中的MVD显著高于多形性腺瘤，并且泪腺多形性腺瘤、腺样囊性癌及多形性腺癌中EGFL7的表达与MVD之间有明显的正相关性，提示EGFL7可能在泪腺上皮性肿瘤的血管生成中起作用。Torben等[23]在基因工程小鼠、免疫缺陷裸鼠模型体内研究中发现相对于单独应用抗 VEGF 药物，联合抗 EGFL7、抗VEGF 能明显减缓肿瘤生长。有研究中发现EGFL7 对转移性直肠癌患者一线化疗联合贝伐单抗有预测价值。因此，EGFL7可能成为恶性泪腺上皮性肿瘤临床进展的一个新的预测因子。

此外，在多形性腺癌及腺样囊性癌组织标本中Ki67的表达明显高于多形性腺瘤及正常泪腺组织，说明在恶性泪腺上皮性肿瘤中的增殖活性明显高于正常泪腺组织及多形性腺瘤。了解EGFL7在泪腺上皮性肿瘤的良恶性肿瘤的进展过程中的表达，这有利于抗血管生成治疗在泪腺上皮性肿瘤中的应用。

通过对EGFL7在泪腺上皮性肿瘤中表达的研究，我们发现EGFL7在泪腺上皮性肿瘤中不仅可以促进肿瘤新生血管的生成，而且一定程度上促进肿瘤的增殖，通过不同的环节、不同方式对肿瘤的生物学行为产生影响，从而促进泪腺上皮性肿瘤发生、发展。通过该实验研究表明，EGFL7可能成为评估泪腺上皮性肿瘤预后的分子标记物，并有可能成为泪腺上皮性肿瘤抗血管治疗的一个潜在靶点。