响应面分析法和单因素分析法优化艾草中黄酮类物质的提取条件

刘羽暄，杜 慧，张换平，申艳红

(1.四川大学 华西基础医学与法医学院，成都 610041；2.安阳工学院 化学与环境工程学院，安阳 455000)

艾草是一种民间药，“家有三年艾，郎中不用来”[1]这句俗语足以说明艾草的重要药用价值。现代临床医学发现，艾灸对多种疾病，如血脂异常、血糖异常[2]、失眠[3]、腹泻[4]、风湿性关节炎[5]，以及过敏性鼻炎[6]等均有良好疗效。艾草的药效主要来自于所含的黄酮类物质。黄酮类物质是一种天然的多酚类化合物，对人体产生的毒性及副作用很小[7]，且集多种药理活性于一身，具有抗抑郁、降低血脂、扩张血管、抗肿瘤等药理活性[8]。黄酮类物质的提取条件一直是从事相关工作的研究者的研究热点。

从艾草中提取黄酮类物质的方法较多，其中，分子荧光光度法具有操作简单方便、灵敏度高、样品用量少、选择性好等优点[9]。由于黄酮类物质在一定条件下能与铝离子结合生成较稳定且具有荧光特性的化合物，因此本工作采用分子荧光光度法测定艾草中黄酮类物质的提取率。

响应面分析法是采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过回归方程的分析，取得最佳工艺参数的一种统计方法。该方法不仅能直观地反映出各因素在单独存在下对响应值的影响，还可以反映出两两因素在交互作用下对响应值的影响。

本工作采用响应面分析法和单因素分析法优化艾草中黄酮类物质的提取条件，以期为艾草中黄酮类物质的提取提供可参考的依据。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

T6新世型纪紫外可见分光光度计；F-7000 型分子荧光光度计；FA 10048型电子分析天平；KQ-250B型超声清洗器。

芦丁标准溶液:称取芦丁标准品0.302 6 g，用50%乙醇溶液(体积分数，下同)溶解并稀释至100.0 mL，配制成3.026 g·L－1的芦丁标准溶液。

标准曲线用溶液系列:在0.20，0.30，0.40，0.50，0.60 mL的芦丁标准溶液中，分别依次加入5.3 g·L－1硝酸铝溶液2.38 mL，乙酸-乙酸钠缓冲溶液0.90 mL，最后用50%乙醇溶液定容至10.0 mL，待溶液荧光配位反应完成后，即得到标准曲线用溶液系列。

芦丁标准品的纯度不小于98%；其他试剂均为分析纯；乙酸-乙酸钠缓冲溶液(p H 5.61)；试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

发射波长为398 nm；激发和发射光谱通带宽度均为10 nm；荧光光谱扫描范围为400～600 nm。

1.3 试验方法

将艾叶粉末置于温度为50℃的恒温干燥箱中，干燥至恒重后密封于广口瓶备用。取艾草粉末0.5 g于提取器中，并加入50%乙醇溶液15 mL，在30 ℃下超声提取30 min，减压过滤，滤液以2 000 r·min－1转速离心30 min，取1 mL 的上清液，依次加入5.3 g·L－1硝酸铝溶液2.38 mL 和pH 5.61乙酸-乙酸钠缓冲溶液0.9 mL，用50%乙醇溶液定容至10.0 mL，振荡20 min，使艾草中的黄酮类物质与铝离子的荧光配位反应完全，在仪器工作条件下测定。黄酮类物质的提取率公式为:

式中:w为黄铜类物质提取率，%；ρ为待测液黄酮类物质质量浓度，g·L－1；D为稀释倍数；V为提取液体积，mL；m为艾草粉末的质量，mg。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制

在仪器工作条件下对标准曲线用标准溶液系列进行测定，以芦丁的质量浓度为横坐标，其对应的荧光强度为纵坐标绘制标准曲线，线性回归方程为y＝1.600×104x＋76.12，相关系数为0.995 4，线性范围为0.006～0.018 g·L－1。

2.2 单因素分析法中黄酮类物质提取条件的优化

2.2.1 乙醇溶液体积分数

按照试验方法考察了40%，50%，60%，70%，80%的乙醇溶液对艾草中黄酮类物质提取率的影响，结果见图1。

图1 乙醇溶液的体积分数对艾草样品中黄酮类物质提取率的影响Fig.1 Effect of the volume fraction of ethanol solution on the rate of extraction of flavonoids from wormwood sample

由图1可知，当使用50%乙醇溶液提取时，艾草中黄酮类物质的提取率较高，试验选择50%乙醇溶液。

2.2.2 超声时间

按照试验方法考察了超声时间分别为10，20，30，40，50 min时对艾草中黄酮类物质提取率的影响，结果见图2。

图2 超声提取时间对艾草样品中黄酮类物质提取率的影响Fig.2 Effect of the time of ultrasonic extraction on the rate of extraction of flavonoids from wormwood sample

由图2可知:随着超声时间的延长，艾草中黄酮类物质的提取率一直增加；当超声时间为40 min时，提取率较大；当超声时间大于40 min时，提取率大幅度下降。因此，试验选择超声时间为40 min。

2.2.3 艾草样品质量和乙醇溶液体积的比值

分别称取艾草粉末0.300 8，0.501 4，1.001 0，1.501 1，2.015 g，移取50%乙醇溶液15 mL，对应艾草样品质量和50%乙醇溶液体积的比值(料液比)分别为0.3∶15，0.5∶15，1.0∶15，1.5∶15，2.0∶15，按试验方法进行测定，结果见图3。

图3 艾草样品质量和乙醇溶液体积比值对黄酮类物质提取率的影响Fig.3 Effect of the ratio of mass of wormwood sample to volume of ethanol solution on the rate of extraction of flavonoids

由图3可知:艾草中黄酮类物质的提取率随着料液比的增大呈现先增大后减小的趋势，当料液比为1.0 g∶15 mL的时候，提取率较高。在单因素最优条件下，艾草中黄酮类物质的提取率为1.07%。

2.3 响应面分析法中黄酮类物质提取条件的优化

以乙醇体积分数、超声时间、料液比三个因素为响应面法优化因素，利用Design Expert 8.0软件进行三因素三水平设计，见表1。

表1 析因试验中的因素与水平表Tab.1 Factors and levels in factorial design

2.3.1 回归模型的建立与方差分析

按照试验方法对响应面法设计的17组方案进行测试，结果见表2。对表2中的数据采取二次多项式回归模型进行拟合分析，得到的二次多项式回归方程为Y＝1.02＋1.175×10－3A－0.026B－0.14C＋0.028AB－0.060AC＋0.12BC－0.093A2－0.011B2－0.31C2，方程中三因素系数的绝对值反映了这三个因素对黄酮类物质荧光强度的影响程度。

表2 响应面设计及提取率结果Tab.2 Response surface design and results of rate of extraction

为检验模型的有效性，对表2中的数据进行响应面回归模型方差分析[10]，结果见表3，其中，“∗∗”为差异性极显著(P＜0.000 1)；“∗”为差异性显著(P＜0.05)。

表3 响应面回归模型方差分析结果Tab.3 Results of variance analysis of the response surface regression model

表3 (续)

由表3可以看出:模型的F值为13.72，且P值小于0.01，说明此模型的显著性极高。失拟项的F值为2.83，P值大于0.05，说明失拟项不显著，表明此模型模拟性较好[11]。在回归模型中，F值越大，该因素对响应面的影响就越大，乙醇体积分数、超声时间、料液比对提取率的影响顺序按从小到大排列依次是乙醇体积分数、超声时间、料液比。方程的一次项C，交互项BC，二次项A2、C2的P值均小于0.05，说明这些因素对提取率的影响都较显著。模型R2为0.975 4，说明该模型的拟合度较好，乙醇体积分数、超声时间、料液比和艾草中黄酮类物质提取率的非线性关系比较显著。

该模型的显著性强，可靠程度高，可以对试验结果进行预测和分析。

2.3.2 不同因素下的响应面分析

对上述试验结果进行分析，能够得到不同因素下的响应面图及等高线图，而等高线图的形状能够反映出两个因素交互作用的强弱和显著程度[12]，等高线是圆形表示两个变量之间的交互作用不明显，是椭圆形表示两个变量之间交互作用明显[13-14]；响应面图是响应值对各试验因素所构成的三维空间曲线图，响应曲面越陡峭，说明该因素对试验结果的影响越大[15]。

固定料液比，乙醇体积分数和超声时间对艾草中黄酮类物质提取率影响的响应面图(a)和等高线图(b)见图4。

图4 乙醇质量分数和超声时间对艾草中黄酮类物质提取率影响的响应面图和等高线图Fig.4 Response surface and contour maps showing effect of the volume fraction of ethanol solution and time of ultrasonic extraction on the rate of extraction of flavonoids from wormwood

由图4可以看出:响应面图比较平缓，等高线图的形状接近椭圆，由此可知，当固定料液比时，乙醇体积分数与超声时间之间的交互作用不太显著。

固定超声时间，乙醇体积分数和料液比对艾草中黄酮类物质提取率影响的响应面图和等高线图见图5。

由图5可以看出:响应面图比较陡峭，等高线图的形状是椭圆，由此可知，当固定超声时间时，乙醇体积分数与料液比对试验结果的影响较大，两者之间的交互作用非常显著。

固定乙醇体积分数，料液比和超声时间对艾草中黄酮类物质提取率影响的响应面图和等高线图见图6。

由图6可以看出:响应面图比较陡峭，等高线图的形状接近椭圆，由此可知，当固定乙醇体积分数时，超声时间与料液比之间的交互作用比较显著。

图5 乙醇体积分数和料液比对艾草中黄酮类物质提取率影响的响应面图和等高线图Fig.5 Response surface and contour maps showing effect of volume fraction of ethanol solution and ratio of mass of wormwood sample to volume of ethanol solution on rate of extraction of flavonoids from wormwood

图6 超声时间和料液比对艾草中黄酮类物质提取率影响的响应面图和等高线图Fig.6 Response surface and contour maps showing effect of time of ultrasonic extraction and ratio of mass of wormwood sample to volume of ethanol solution on rate of extraction of flavonoids from wormwood

以上分析可以进一步优化得到最佳提取条件:乙醇体积分数为49.96%，超声时间为30 min，料液比为0.79 g:15 mL，在此条件下提取率可达1.09%。

2.3.3 验证试验

在优化出的最佳试验条件下做平行试验进行验证。分别称取0.790 4，0.790 2，0.789 7 g艾草粉末，各加入49.96%乙醇溶液15 mL，按照试验方法进行测定并计算艾草中黄酮类物质的提取率，得到的平均提取率为1.08%，与理论值的相对误差为－0.92%，说明此模型准确可靠，可以用于预测不同的提取条件下艾草中黄酮类物质的提取率。

本工作基于荧光光度法测定的艾叶中的黄酮类物质提取率的数据进行了单因素分析和方差分析，建立了响应值与乙醇体积分数、超声时间、料液比等三因素的二次多项式模型，优化得到了艾叶中黄铜类物质的最佳提取条件，试验验证结果满意。该模型可靠性高，可用于预测艾叶中黄酮类物质的提取率。